染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白4在肝癌細(xì)胞增殖和侵襲中的作用及其調(diào)控機(jī)制.pdf

1、一、研究背景
　　原發(fā)性肝癌最常見(jiàn)類(lèi)型為肝細(xì)胞肝癌,它在全球最致命癌癥中排名第三,僅次于肺癌和胃癌。全球每年有750,000新發(fā)病例,肝細(xì)胞肝癌還是全球第六常見(jiàn)腫瘤,在其檢測(cè)和治療方面,目前仍存在著非常大的爭(zhēng)議。小肝癌治療效果非常好,但是由于肝癌的隱匿性較高,臨床癥狀不明顯,臨床診斷的大部分肝癌患者,都已發(fā)展到腫瘤晚期,對(duì)晚期肝癌有效的治療手段非常有限。從分子生物學(xué)角度來(lái)看,肝癌是高度異構(gòu)型腫瘤。越來(lái)越多的研究表明,肝癌的復(fù)雜性和

2、臨床多樣性,主要是由于基因在疾病發(fā)生和發(fā)展的過(guò)程中的變異越來(lái)越多。有文獻(xiàn)報(bào)道,肝癌的發(fā)生和發(fā)展是由于各種細(xì)胞通路的異常激活,比GSK-3β-C/EBPα-miR-122-IGF1R、HDGF-related protein-3、FoxM1/ACP5、JAK/Stat等等。而且,有研究表明JAK/Stat細(xì)胞通路在肝癌的發(fā)展過(guò)程中起著非常重要的作用,通過(guò)抑制JAK/Stat通路,對(duì)肝癌的治療起著非常重要的作用。因此,鑒別新的肝癌的分子調(diào)控

3、機(jī)制,目前已作為肝癌治療的重要的研究領(lǐng)域和熱點(diǎn)。
　　二、研究目的
　　本研究旨在研究染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白4(structural maintenance of chromosome4, SMC4)在肝癌細(xì)胞侵襲和增殖中的重要作用及其調(diào)控機(jī)制。
　　三、材料和方法
　　1.原發(fā)性肝癌組織、癌旁組織、正常肝臟組織各72例,均來(lái)自原發(fā)性肝癌患者標(biāo)本。Real-time PCR、western blotting和IHC檢

4、測(cè)SMC4在肝癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析SMC4的表達(dá)水平與患者臨床參數(shù)之間的關(guān)系。
　　2.為了研究SMC4在肝癌中的作用,首先合成3個(gè)干擾片段和1個(gè)陰性對(duì)照,并利用real-time PCR和western blotting技術(shù)篩選出SMC4的最佳干擾片段。構(gòu)建的SMC4干擾載體(homo-830),利用轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞中進(jìn)行深入研究。利用細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn),研究SMC4在肝癌細(xì)胞侵襲中的作用;

5、細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)和WST-1實(shí)驗(yàn),檢測(cè)SMC4在肝癌細(xì)胞增殖中的作用。
　　3.利用生物信息學(xué)軟件對(duì)SMC4的3’UTR進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-219與SMC4有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。利用real-time PCR技術(shù)檢測(cè)miR-219在肝癌組織和肝癌細(xì)胞中的表達(dá)情況。將 miR-219的模擬物和抑制物,分別轉(zhuǎn)染到97-H和 HepG2細(xì)胞中,利用real-time PCR和western blotting技術(shù)檢測(cè)SMC4在肝癌細(xì)胞中表

6、達(dá)情況的變化。熒光素酶報(bào)告基因技術(shù),分析miR-219與SMC4結(jié)合活性。
　　4.通過(guò)PIPs和Donime軟件對(duì)SMC4的下游調(diào)控因子進(jìn)行分析,結(jié)果提示JAK2/Stat3為SMC4潛在的下游調(diào)控位點(diǎn)。利用real-time PCR和western blotting技術(shù)對(duì)JAK2/Stat3在肝癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析。通過(guò)轉(zhuǎn)染SMC4干擾載體(homo-830),利用real-time PCR和western blo

7、tting分析SMC4和JAK2/Stat3之間的調(diào)控關(guān)系,免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)Stat3的磷酸化位點(diǎn)。最后,通過(guò)干擾miR-219的表達(dá)變化,利用western blotting技術(shù)研究miR-219與JAK2/Stat3之間的調(diào)控關(guān)系及Stat3的磷酸化情況。
　　四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　利用 SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩樣本均值組間比較采用t檢驗(yàn),SMC4的表達(dá)水平與臨床參數(shù)之間的關(guān)系采用 U檢驗(yàn),計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)

8、差來(lái)表示,P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　五、結(jié)果
　　1. Real-time PCR和 western blotting結(jié)果均提示,SMC4在肝癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)明顯上調(diào),相對(duì)于正常對(duì)照組;免疫組化結(jié)果也提示,SMC4在肝癌組織中的表達(dá)明顯上調(diào)。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果得出,SMC4在肝癌中的表達(dá)水平與腫瘤大小、細(xì)胞分化、TNM分期和血管侵犯有關(guān),而與患者的年齡、性別和腫瘤類(lèi)型無(wú)關(guān)。預(yù)示著 SMC4的表達(dá)水平可能與肝癌患者的不良預(yù)后

9、有關(guān)。
　　2. Real-time PCR和 western blotting結(jié)果提示,homo-830為SMC4的最佳干擾片段。細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,與轉(zhuǎn)染空載體和未轉(zhuǎn)染組相比,轉(zhuǎn)染SMC4干擾載體組的肝癌細(xì)胞其遷移率明顯降低;細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)表明,實(shí)驗(yàn)組中肝癌細(xì)胞增殖率明顯降低;WST-1實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,轉(zhuǎn)染SMC4干擾載體后,肝癌細(xì)胞的增殖率由100％下降到73.4%。因此,以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:SMC4在促進(jìn)

10、肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲過(guò)程中起著非常重要的作用。
　　3. miR-219在4組肝癌細(xì)胞和肝癌組織標(biāo)本中的表達(dá)明顯下調(diào)。當(dāng)miR-219模擬物和抑制物分別轉(zhuǎn)染到97-H和HepG2細(xì)胞中,real-time PCR和western blotting檢測(cè)結(jié)果均提示:miR-219沉默后,會(huì)導(dǎo)致SMC4的表達(dá)明顯上調(diào);而且miR-219表達(dá)增強(qiáng)后,也會(huì)導(dǎo)致SMC4表達(dá)的顯著下調(diào)。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果也提示,miR-219和 SMC4

11、之間存在著負(fù)向調(diào)控關(guān)系。
　　4. Real-time PCR和western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,在基因水平和蛋白水平,JAK2/Stat3在肝癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)水平均明顯上調(diào)。SMC4干擾載體(homo-830)轉(zhuǎn)染到97-H和HepG2細(xì)胞中,real-time PCR和western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示,無(wú)論在基因水平,還是蛋白水平,JAK2/Stat3的表達(dá)都隨著SMC4的降低而降低。免疫共沉淀實(shí)

12、驗(yàn)結(jié)果顯示,p-Stat3的磷酸化位點(diǎn)為第705號(hào)酪氨酸,而第727號(hào)絲氨酸的表達(dá)無(wú)顯著變化。Western blotting結(jié)果提示,在97-H和 HepG2細(xì)胞中,miR-219與JAK2/Stat3也存在著負(fù)向調(diào)控關(guān)系,酪氨酸的表達(dá)也隨著發(fā)生變化。
　　六、結(jié)論
　　SMC4在肝癌中表達(dá)明顯上調(diào),其表達(dá)水平與腫瘤大小、細(xì)胞分化、TNM分期和血管侵犯有關(guān);SMC4能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲;本研究第一次完整研究了肝癌中