家蠶生物反應(yīng)器表達(dá)人乳鐵蛋白及其功能研究.pdf

1、人乳鐵蛋白是一種多功能的鐵結(jié)合糖蛋白。本研究利用家蠶核型多角體桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了重組人乳鐵蛋白。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用RT-PCR技術(shù)從人的乳腺組織中克隆了人乳鐵蛋白(hLF)cDNA。BLAST分析測(cè)序結(jié)果表明重組人乳鐵蛋白其DNA序列與GenBank中另外4個(gè)hLFcDNA序列具有高度的同源性(同源性達(dá)到99％)。序列之間的差異可能是由hLFmRNA本身的多態(tài)性造成，也可能是由于中國(guó)人hLF的特殊性引起。這些差異引起的氨基酸變化對(duì)人乳鐵

2、蛋白生物活性的影響還有待于進(jìn)一步研究。 將人乳鐵蛋白cDNA克隆在質(zhì)粒pBacPAK8的BamHⅠ位點(diǎn)和XhoⅠ位點(diǎn)，構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBacPAK-hLF。該質(zhì)粒DNA與已線性化BacPAK6DNA共轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞BmN，在培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞中挑出空斑，經(jīng)過(guò)3輪純化，獲得重組病毒vBm-hLF。 本研究利用重組病毒感染家蠶細(xì)胞和家蠶幼蟲作為宿主表達(dá)重組人乳鐵蛋白。經(jīng)12％SDS-PAGE和Westernblotting鑒定

3、表明在重組病毒感染的家蠶細(xì)胞和家蠶幼蟲中存在人乳鐵蛋白基因的表達(dá)產(chǎn)物。表達(dá)產(chǎn)物分子量約為78kDa，略低于天然乳鐵蛋白分子量，估計(jì)可能為不完全糖基化或者蛋白降解造成。 在感染了重組病毒的家蠶細(xì)胞中，大約105家蠶細(xì)胞可以獲得13.5μgrhLF。體外生物活性研究表明重組人乳鐵蛋白和天然乳鐵蛋白具有類似的抑菌活性，能夠抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)，而且重組人乳鐵蛋白的抑菌活性還稍強(qiáng)些。這可能與蛋白的糖基化程度和結(jié)合鐵的飽和度不同有關(guān)。此研究

4、為重組人乳鐵蛋白作為一種食品，醫(yī)藥，化妝品中的天然有效的抗菌劑提供了理論基礎(chǔ)。 在感染了重組病毒的家蠶幼蟲中，大約每升家蠶血淋巴中可以獲得192毫克重組人乳鐵蛋白。重組人乳鐵蛋白表達(dá)量在感染重組病毒120小時(shí)后達(dá)到最大，隨后迅速降低。體內(nèi)生物活性研究了重組人乳鐵蛋白對(duì)葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的小鼠急性結(jié)腸炎的預(yù)防作用。研究結(jié)果表明重組人乳鐵蛋白可以顯著的抑制DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥狀，這為重組人乳鐵蛋白作為急性腸道疾病的治療劑或者