誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(iPS)對小鼠下肢缺血再灌注損傷的保護(hù)作用研究.pdf

1、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPS cells）是一種新型干細(xì)胞，系經(jīng)轉(zhuǎn)入4個特定的轉(zhuǎn)錄因子(Oct3/4，Sox2，Klf4、c-Myc)到小鼠或人的體細(xì)胞，誘導(dǎo)其重編程為未分化的多能細(xì)胞。它可分化成內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和外膜細(xì)胞，通過移植hiPSCs衍生的這些細(xì)胞可以促進(jìn)血管和肌肉的再生。針對局部缺血損傷，iPS細(xì)胞發(fā)揮其作用依賴于其定向富集于損傷部位。
　　目的：本工作擬在i

2、PS細(xì)胞，研究miNA對iPS細(xì)胞的遷移、黏附影響；建立小鼠急性下肢缺血再灌注損傷缺血模型，觀察iPS細(xì)胞是否對下肢缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。
　　方法：我們在成功制備出誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞的前提下進(jìn)行研究。首先體外研究：向iPS細(xì)胞轉(zhuǎn)染consiRNA和miRNA217觀察轉(zhuǎn)染后的iPS細(xì)胞遷移粘附的情況。體外：以C57BL/6J，8-10周齡雄性小鼠，制作小鼠下肢缺血再灌注損傷模型，右下肢作為對照組，分別在術(shù)后當(dāng)天和第二天從尾靜脈

3、注射pbs、ips、mef（胚胎成纖維細(xì)胞）、controlsiRNA+ips、miRNA-217+ips6?104個/只/次/200ul.。細(xì)胞事先用紅色熒光染料處理，觀察72h后取材。
　　結(jié)果：⑴參照Yamanaka方法成功制備出誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞。⑵給予miRNA-217刺激iPS細(xì)胞后，對 iPS細(xì)胞的遷移能力無明顯影響。⑶在急性小鼠缺血再灌注損傷模型，觀察到ips形態(tài)呈梭形,ips細(xì)胞可以歸巢到缺血/再灌注損傷的股動脈

4、血管內(nèi)膜。⑷缺血再灌注損傷小鼠尾靜脈注射 ips細(xì)胞或 MEF后28天，小鼠組織器官均無肉眼可見的腫瘤發(fā)生。⑸尾靜脈注射iPS細(xì)胞組較PBS和MEF組下肢缺血損傷側(cè)肢體的血流灌注明顯改善（*P<0.05），而經(jīng)Lipo2000和miRNA-217預(yù)處理的 iPS組較單獨注射iPSCs組的治療效果明顯下降（*P<0.05）。⑹在損傷的后肢組織HE染色顯示：iPS細(xì)胞組肌細(xì)胞核數(shù)量明顯多于MEF、PBS、con-siRNA+iPS和mirR

5、NA-217組，后4組的細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)無明顯差異（n=9）。⑺DiI(呈紅色熒光)標(biāo)記的 iPS細(xì)胞的定位顯示，iPS組較consiRNA+iPS組和miRNA-217+iPS2組小鼠損傷組織中陽性細(xì)胞數(shù)明顯多（P<0.05）。⑻CD31免疫熒光化學(xué)方法檢后肢缺血再灌注損傷部位小鼠肌肉組織血管的改變情況：陽性計數(shù)在PBS、MEF、iPS、con-siRNA+iPS、miRNA217+iPS5組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異。⑼實時PCR檢測顯示：注

6、射iPS和con-siRNA-iPS組在各個基因中的變化趨勢一致。在iPS、con-siRNA-iPS、miR-217-iPS3個組的IL-1βmRNA表達(dá)水平比PBS(1±0.24)和MEF(0.86±0.4)明顯升高，有統(tǒng)計學(xué)差異。IL-2mRNA在iPS組的表達(dá)明顯高于其余4組。TNF-α和MCP-1基因在iPS組表達(dá)水平最低，與其余4組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異。IGF-1表達(dá)水平在 iPS、con-siRNA-iPS，miR-217-

7、iPS3個組中的表達(dá)水平均較 PBS和MEF組高（P<0.05）。其余基因在各組之間比較無統(tǒng)計學(xué)差異。⑽Teto定量：IPS細(xì)胞組的總DNA中Teto含量最高，與PBS組和MEF組比，iPS細(xì)胞組和miRNA217+iPS細(xì)胞組有顯著性差異（*P<0.05）；與其他細(xì)胞組相比，IPS細(xì)胞組 Teto含量明顯多（*P<0.05）。
　　結(jié)論：iPS細(xì)胞可定向歸巢到缺血/再灌注損傷部位，本實驗劑量6104個/只/次/200ul下無成瘤