基于差異基因cDNA文庫基礎(chǔ)上耐藥性癲癇患者腦內(nèi)特異性標(biāo)示蛋白篩選和機(jī)制探討.pdf

1、第一部分：耐藥性癲癇患者腦中差異表達(dá)基因的篩選目的：利用基因芯片和生物信息學(xué)理論篩選耐藥性癲癇患者術(shù)后腦組織中差異表達(dá)基因，通過對(duì)其功能和相互關(guān)系的分析，探討建立耐藥性癲癇患者腦內(nèi)差異表達(dá)基因的cDNA文庫，同步了解耐藥性癲癇患者腦內(nèi)是否存在耐藥性癲癇新的致病基因，進(jìn)一步完善對(duì)耐藥性癲癇基因機(jī)制的認(rèn)識(shí)。 方法：收集耐藥性癲癇患者和對(duì)照組腦組織，常規(guī)病理學(xué)檢查(HE染色、硝酸銀染色、尼氏染色)后，抽提兩組腦組織RNA，純化mRNA

2、，分別逆轉(zhuǎn)錄合成熒光分子摻入cDNA-鏈做探針；將含4096條人類基因PCR產(chǎn)物按微矩陣點(diǎn)樣于化學(xué)涂層的栽玻片上，制成基因芯片，芯片雜交和洗片后，用ScanArray4000熒光掃描儀掃描芯片熒光信號(hào)圖象，計(jì)算機(jī)分析耐藥性癲癇患者和對(duì)照組腦組織差異表達(dá)的基因；生物信息學(xué)篩選出與耐藥性癲癇發(fā)病相關(guān)的差異候選基因，采用RT-PCR對(duì)酪蛋白激酶2(CSNK2A1)，層粘連蛋白β1(LAMB1)，肌紅蛋白1E(MYO1E)，微管蛋白δ1(TUB

3、D1)，微管蛋白γ1(TUBG1)，鈣粘蛋白18,type 2(Cadherin 18 type2)，微管相關(guān)蛋白1A(MAP1A)，微管相關(guān)蛋白1B(MAP1B)，微管相關(guān)蛋白2(MAP2)，周期性依賴蛋白激酶5(CDK5)，分裂素激活蛋白激酶14(MAPK14)，糖原合成激酶-3β(GSK-3β)基因進(jìn)行驗(yàn)證；實(shí)時(shí)熒光PCR(FQ-PCR)對(duì)MAP1A，MAP1B,MAP2，WDR3，CDK5，MAPK14，GSK-3β，HSPBA

4、P1，REDD1，EML5，MARK1，TRAP220，小腦變性相關(guān)蛋白(CDR2)mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：1、耐藥性癲癇患者術(shù)后腦組織常規(guī)病理學(xué)檢查提示神經(jīng)元壞死、凋亡、膠質(zhì)細(xì)胞增生，神經(jīng)纖維增多，走行紊亂是耐藥性癲癇最常見的病理改變；2、耐藥性癲癇患者腦內(nèi)有142條基因與對(duì)照組比效表達(dá)有顯著差異(104條(73.2％)表達(dá)上調(diào)，38條(26.8％)表達(dá)下調(diào))，按生物學(xué)功能分類，發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)的基因主要集中在信號(hào)傳導(dǎo)(20條)、

5、離子通道(3條)、細(xì)胞骨架基因(9條)、凋亡(7條)、細(xì)胞受體(3條)、代謝(6條)、癌基因(4條)及發(fā)育(9條)等，提示耐藥性癲癇的發(fā)生可能與細(xì)胞骨架、凋亡、離子通道、代謝、免疫等。3RT-PCR驗(yàn)證的12條基因結(jié)果與基因芯片一致；除MARK1外，F(xiàn)Q-PCR檢測(cè)結(jié)果與基因芯片相符，從另一個(gè)側(cè)面支持基因芯片檢測(cè)結(jié)果。 結(jié)論： 1、耐藥性癲癇發(fā)病機(jī)制可能與多個(gè)不同功能的基因組相互作用有關(guān)，而非單一基因作用；2、差異表達(dá)基因主要集

6、中在離子通道、凋亡、細(xì)胞骨架、信號(hào)傳導(dǎo)及其腫瘤相關(guān)基因等；3、耐藥性癲癇患者腦組織中存在人類尚不清楚的耐藥性癲癇新致病基因；4、基因芯片技術(shù)具有高通量、高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，能發(fā)現(xiàn)新致病基因，但存在假陽性，需結(jié)合傳統(tǒng)分子生物學(xué)技術(shù)驗(yàn)證。 第二部分：基于差異cDNA文庫基礎(chǔ)上耐藥性癲癇患者腦內(nèi)特異性蛋白篩選和機(jī)制研究目的：蛋白是基因功能的執(zhí)行單位，本文研究的目的就是希望在差異表達(dá)基因cDNA文庫基礎(chǔ)上通過研究其相關(guān)蛋白，篩選出耐藥性癲癇

7、患者腦內(nèi)特異性，標(biāo)示性的蛋白質(zhì)，進(jìn)而探討耐藥性癲癇患者新的發(fā)病機(jī)制，提出耐藥性癲癇防治的新觀點(diǎn)，為抗癲癇新藥的開發(fā)提供新的作用靶點(diǎn)。 方法：收集耐藥性癲癇患者和對(duì)照組顳葉標(biāo)本，采用免疫組化、免疫熒光、western blot分別對(duì)細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK1)，ERK2，磷酸化細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)激酶1/2(P-ERK1/2)，TAU蛋白、P-TAU蛋白(se

8、r202，ser404)、糖原合成激酶-3Beta(GSK-3β)、磷酸化糖原合成激酶(ser9)(P-GSK-3β(ser9))、微管相關(guān)蛋白2(microtubular-associated protein，MAP2)、T細(xì)胞死亡相關(guān)基因51(T cell death-associated gene 51，TDAG51)、胰島素樣生長因子-1(Insulin-like growth factor-I，IGF-I)、MAPK14和磷酸

9、化MAPK14(thr182/tyr184)、CDR2總共14個(gè)蛋白的表達(dá)部位和表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)一步探討其在耐藥性癲癇發(fā)病機(jī)制中的作用。 結(jié)果：IGF-1、TDAG51、MAPK14、磷酸化MAPK14(Thr180/Tyr182)、MAP2、TAU蛋白、磷酸化TAU蛋白(ser202，ser404)、CDK5、GSK-3β、P-GSK-3β(ser9)、ERK1、ERK2、P-ERK1/2(Thr202/Tyr204)免疫反

10、應(yīng)產(chǎn)物均為棕黃色點(diǎn)狀或顆粒狀沉積，神經(jīng)元胞體和細(xì)胞核均有表達(dá)，部分膠質(zhì)細(xì)胞也存在表達(dá)。各組腦組織間，可見著色深淺有明顯差異，陰性對(duì)照組未見免疫反應(yīng)產(chǎn)物表達(dá)。除TAU蛋白無改變和P-GSK-3β(ser9)耐藥性癲癇組降低外，癲癇患者腦組織中上述蛋白的表達(dá)較正常對(duì)照組高CDR2見于實(shí)驗(yàn)組腦組織中，對(duì)照組中未見明顯陽性細(xì)胞。ERK1、ERK2不同病理改變即神經(jīng)元丟失組和膠質(zhì)細(xì)胞增生組之間無明顯改變，而P-ERK1/2(Thr202/Tyr2

11、04)在膠質(zhì)細(xì)胞增生組明顯高于非膠質(zhì)細(xì)胞增生組。免疫熒光與免疫組化結(jié)果類似，western blot檢測(cè)顯示各個(gè)蛋白在相應(yīng)的分子量處表達(dá)，其表達(dá)量的高低與免疫組化相符。結(jié)論：1耐藥性癲癇患者基因表達(dá)有差異，其基因的表達(dá)產(chǎn)物亦有類似結(jié)果；2差異表達(dá)的不是單一蛋白，而是具有相互作用的蛋白如TDAG51相關(guān)蛋白(IGF-1，MAPK14,CDR2)和TAU蛋白相關(guān)蛋白(GSK-3β，P-GSK-3β，CDK5,ERK1，ERK2,P-ERK1