Fabry病診斷體系及GLA基因突變型的臨床與基礎(chǔ)研究.pdf

1、Fabry病是一種少見的,以x連鎖方式遺傳的溶酶體貯積病 (lysosomal storagediseases,LSDs),男性新生兒的發(fā)病率約為1/40000.其發(fā)病機(jī)制是由于GLA基因突變導(dǎo)致α-半乳糖苷酶A(α-galA)的活性缺失或下降,致使鞘糖脂代謝出現(xiàn)異常,在機(jī)體血管內(nèi)皮細(xì)胞及腎臟、心臟、皮膚、眼及神經(jīng)系統(tǒng)等組織沉積,最終導(dǎo)致受累臟器的缺血性損害. 本研究首先對臨床診斷的17例Fabry病先證者及59例家系成員進(jìn)行了

2、GLA基因檢測,在17個(gè)家系中發(fā)現(xiàn)16種GLA基因突變,包括11種錯(cuò)義突變,2種無義突變,1個(gè)剪切突變,1個(gè)單堿基缺失和1個(gè)大片段缺失.這些突變散在GLA基因的2、3、4、5、6、7等外顯子,16種突變中有十種突變(D165Y,L206P,F273L,A291T,A292P,W349R,R356G,IVS1-1G>A,1082DelG,44 bp nt.1077)為人類基因突變庫中尚未見報(bào)道的新突變. 為了規(guī)范和完善Fabry病

3、的診斷平臺,本研究建立了外周血粒細(xì)胞α-galA活性的檢測方法并分別檢測13例男性半合子、8例女性雜合子和32例正常對照.男性半合子平均酶活性0.45±0.32nmol/hr/mg,所有男性半合子的α-galA酶活性值均遠(yuǎn)低于正常人水平,經(jīng)典型患者低于正常值的1﹪,易于與正常人群區(qū)分,因此酶活性檢測可以作為篩檢 Fabry 病半合子的可靠手段.女性雜合子平均酶活性19.12±9.98nmol/hr/mg,其中兩例雜合子患者酶活性結(jié)果處于

4、臨床正常值參考范圍內(nèi),因此對于疑診Fabry病的女性受檢者或Fabry病家系女性成員,必須通過基因檢測才能確診.外周血粒細(xì)胞α-gal A活性檢測具有操作簡單、方便、診斷快速、低成本等優(yōu)點(diǎn). 本研究第三部分對16個(gè)家系的65例家系成員進(jìn)行了外周血粒細(xì)胞α-gal活性和/或GLA基因突變篩查, 檢出與先證者攜帶同樣GLA基因突變的5例Fabry病半合子和22例雜合子.將本研究所確診的21例半合子及25例雜合子的臨床表型、基因型及酶

5、活性結(jié)果進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)Fabry病的漏、誤診及延誤診斷仍是普遍問題.半合子主要表現(xiàn)包括蛋白尿85﹪,腎功能不全50﹪,LVH355﹪,疼痛62﹪,血管角質(zhì)瘤45﹪,少汗65﹪；雜合子主要表現(xiàn)包括疼痛16﹪,蛋白尿24﹪,LVNH60﹪.腎臟及心腦血管并發(fā)癥是成年Fabry病患者面臨的主要風(fēng)險(xiǎn),Fabry病的多系統(tǒng)受累及其評估應(yīng)引起重視.男性半合子的突變類型和酶活性水平及臨床表型具有一定相關(guān)性,而女性雜合子的突變類型類型及酶活性與臨床表型

6、無明顯相關(guān). 研究在最后將野生型GIA基因的真核表達(dá)質(zhì)粒定點(diǎn)突變,構(gòu)建了3種突變型GLA基因真核表達(dá)質(zhì)粒(A291T,R301Q,1082DelG),并分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞,48小時(shí)后測酶活性突變型組酶活性均顯著低于野生型(p<0.01),A291T、1082DelG和R301Q在體外表達(dá)后的a-gal A酶活性依次為R301Q>A291T>1082DelG,與攜帶相應(yīng)突變類型的半合子臨床表型嚴(yán)重程度相符.體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這

7、些GIA突變型的致病性,并為判斷不同突變類型導(dǎo)致酶活性不同程度的下降提供了依據(jù).進(jìn)一步使用20μM的脫氧半乳糖野生霉素(deoxygalactonojirimycin,DGJ)對轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后發(fā)現(xiàn).A29lT和R301Q突變型轉(zhuǎn)染組的酶活性均上升2倍以上(p<0.05),而1082DelG組酶活性上升不明顯,提示A291T和.R301Q兩種突變型對酶增強(qiáng)治療可能有效,從而初步建立了小分子競爭性抑制劑治療Fabry病的體外