外源性一氧化碳釋放分子（CORM）2預(yù)處理對(duì)膿毒癥早期炎癥反應(yīng)的抑制作用及分子機(jī)制.pdf

1、膿毒癥(Sepsis)是指各種致病微生物或其毒素存在于血液或組織中，是機(jī)體對(duì)感染的一種全身性炎癥反應(yīng)(SIR)，表現(xiàn)為不能控制的炎癥反應(yīng)，膿毒癥和SIRS在性質(zhì)和臨床表現(xiàn)上基本是一致的，只是病因不同而已。炎癥反應(yīng)是感染或非感染因素如細(xì)菌感染、外傷、燒傷、較大外科手術(shù)等，刺激宿主免疫系統(tǒng)，釋放細(xì)胞炎癥介質(zhì)，發(fā)生的一種臨床病理過程。以細(xì)胞因子為代表的多種炎癥介質(zhì)的失控性釋放，產(chǎn)生過度炎癥反應(yīng)，不僅不能去除機(jī)體的致病因素，反而會(huì)抑制免疫系統(tǒng)。

2、其繼續(xù)發(fā)展則可以導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)、膿毒癥和多器官功能不全。其共同病理生理特征是自身的免疫失控、體內(nèi)白細(xì)胞大量激活，產(chǎn)生過量的炎癥介質(zhì)而引起全身多個(gè)臟器損傷。 一氧化碳(carbon monoxide，CO)在機(jī)體內(nèi)由血紅素加氧酶(HO)催化血紅素產(chǎn)生，CO過去曾被認(rèn)為是破壞細(xì)胞呼吸作用的有害物質(zhì)。最近的研究發(fā)現(xiàn)CO是一種氣體信號(hào)分子的，在損傷誘導(dǎo)的各種機(jī)體應(yīng)激中具有保護(hù)組織的作用，并且CO在心血管、神經(jīng)和免疫的

3、生理和病理過程中都起著重要的調(diào)節(jié)作用。我們研究發(fā)現(xiàn)CO對(duì)炎癥反應(yīng)也具有抑制作用，但其機(jī)制尚未明確。 在本研究中，我們利用可以在機(jī)體內(nèi)釋放CO的一種新型金屬一羰基化合物，一氧化碳釋放分子(tricarbonyldichlororuthenium(II)dimer， CORM-2)，通過體外預(yù)處理和在體實(shí)驗(yàn)研究是否外源性CO對(duì)炎癥反應(yīng)具有抑制作用及其有效濃度范圍，并且探討CO的作用機(jī)制。 第一部分HUVEC模型的建立及驗(yàn)證目

4、的血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)是機(jī)體中一類重要的細(xì)胞群體，在體內(nèi)廣泛分布形成血液和組織之間的界面，構(gòu)成機(jī)體的天然免疫屏障，具有重要的分泌、合成、代謝和免疫功能。由于新生兒臍帶方便、易取，而且是同種細(xì)胞，排異性小，通過擴(kuò)增可獲得大量的內(nèi)皮細(xì)胞，因此，我們采用HUVEC進(jìn)行炎癥機(jī)制的研究。在各實(shí)驗(yàn)室中， HUVEC培養(yǎng)條件也各異。本實(shí)驗(yàn)即為了創(chuàng)建本實(shí)驗(yàn)室HUVEC標(biāo)準(zhǔn)化模型并對(duì)此模型進(jìn)行驗(yàn)證而進(jìn)行了詳細(xì)的研究。 方法人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Hu

5、man umbilical vein endothelial cell，HUVEC)來源于6小時(shí)內(nèi)新生胎兒臍帶，宜在37℃，含5％CO2、95％濕度的環(huán)境中培養(yǎng)，采用M199培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中應(yīng)含20％熱滅活的小牛血清，10IU/ml肝素，抗生素(1001U/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素)，1.51xg/ml兩性霉素B和80ug/ml內(nèi)皮促有絲分裂劑，在75cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，24h后更換培養(yǎng)液，以后每隔2d換液1次，6-8天后細(xì)胞

6、生長(zhǎng)達(dá)融合。用1ml 0.25％胰蛋白酶和0.025％EDTA混合液(V=l/1)在37℃條件下消化，按1:3的比例傳代。觀察HUVEC的形態(tài)，并且需要對(duì)細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞內(nèi)VIII因子相關(guān)抗原表達(dá)進(jìn)行檢驗(yàn)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并攝片，運(yùn)用免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)VIII因子相關(guān)抗原的表達(dá)。 結(jié)果本實(shí)驗(yàn)室成功建立了HUVEC模型，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生長(zhǎng)良好；經(jīng)驗(yàn)證，該模型細(xì)胞生長(zhǎng)融合后呈典型的鋪路石狀排列，細(xì)胞內(nèi)VIII因子相關(guān)抗原陽性率達(dá)9

7、5％，綠色的顆粒均勻地分布在整個(gè)細(xì)胞漿內(nèi)。 結(jié)論本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的HuVEC在細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)情況和特異性分泌抗原上符合實(shí)驗(yàn)要求。實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定易控，因而在本實(shí)驗(yàn)室條件下生長(zhǎng)的HUVEC模型可以用于體外實(shí)驗(yàn)。 第二部分外源性一氧化碳釋放分子(CORM)2預(yù)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)HUVEC的炎癥反應(yīng)的抑制作用及分子機(jī)制目的為了探討機(jī)體膿毒癥時(shí)的炎癥反應(yīng)機(jī)制，我們采用LPS對(duì)HUVEC進(jìn)行刺激建立細(xì)胞膿毒癥模型，在離體方面研究炎癥反應(yīng)的機(jī)

8、制。CO是一種可擴(kuò)散性氣體信息分子，具有細(xì)胞保護(hù)作用，抗氧化的功能及抗炎作用。但是外源性CO抗炎作用的機(jī)制并未有明確的研究，為了評(píng)價(jià)CORM釋放的CO對(duì)LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞活性的作用及潛在的機(jī)制，本課題也將進(jìn)一步進(jìn)行闡明。 方法取傳代后生長(zhǎng)達(dá)到融合的HUVEC，棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，加入10ug/ml的LPS孵育液200ul，置入培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h，空白對(duì)照組加入200uL M199液后也置入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件均為37℃、5％CO2和

9、95％相對(duì)濕度。運(yùn)用50UM、100uM劑量的CORM-2對(duì)HUVEC預(yù)處理2h，再進(jìn)行LPS刺激4h，或者與LPS共同培養(yǎng)4h后，觀察炎癥反應(yīng)過程當(dāng)中，多種細(xì)胞因子、黏附分子、轉(zhuǎn)錄因子，以及參與炎癥反應(yīng)放大與延續(xù)的多種酶的變化。 結(jié)果HUVEC膿毒癥模型的建立過程規(guī)范，各種條件易于控制，且模型的檢測(cè)指標(biāo)明確：損傷后PMN粘附率明顯增高，NO、ROS活性明顯增加，iNOS、ICAM-1、HO-l蛋白的表達(dá)明顯增加，NF-KB活性

10、也顯著增高。相比與LPS共同培養(yǎng)，CORM-2的預(yù)處理對(duì)于炎癥反應(yīng)具有更加明顯的抑制作用。 結(jié)論對(duì)膿毒癥臨床研究發(fā)現(xiàn)，阻斷炎癥介質(zhì)的作用或應(yīng)用LPS單克隆抗體效果并不明顯。因此，闡明LPS激活內(nèi)皮細(xì)胞的分子調(diào)控機(jī)制顯得十分必要。HUvEC的膿毒癥模型可以用于在細(xì)胞水平研究炎癥的反應(yīng)機(jī)制，各種炎癥因子、黏附分子、轉(zhuǎn)錄因子等都發(fā)生了相應(yīng)的變化。本課題顯示，外源性CO的預(yù)處理及干預(yù)都能抑制炎癥的反應(yīng)，其中外源性CO預(yù)處理的作用較大。這

11、一結(jié)果，對(duì)于臨床危重病人的救治具有十分重要的意義。 第三部分外源性一氧化碳釋放分子(CORM)2對(duì)CLP肝臟小鼠炎癥反應(yīng)的抑制作用及分子機(jī)制目的為明確機(jī)體在嚴(yán)重創(chuàng)傷情況下炎癥反應(yīng)的機(jī)制，我們制作了CLP小鼠的在體模型，并利用此模型研究在嚴(yán)重創(chuàng)傷后肝臟炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步明確嚴(yán)重膿毒癥小鼠損傷后炎性反應(yīng)與HUVEC膿毒癥模型時(shí)炎性反應(yīng)的關(guān)系，同時(shí)重點(diǎn)探討外源性CO對(duì)機(jī)體嚴(yán)重膿毒癥后炎癥反應(yīng)的抑制作用及分子機(jī)制。 方法6.8w大

12、小的小鼠正常飼養(yǎng)1W后，2％異氟烷麻醉進(jìn)行盲腸結(jié)扎穿刺法建立小鼠膿毒癥模型，經(jīng)病理檢測(cè)和生命體征、細(xì)胞因子、黏附分子、轉(zhuǎn)錄因子及參與炎癥反應(yīng)放大與延續(xù)的多種酶等指標(biāo)確定模型的標(biāo)準(zhǔn)化。小鼠在CLP后立即靜脈注射CORM-2(8.0mg/kg)，加入在152ul生理鹽水中，以正常小鼠為對(duì)照組。測(cè)定CLP 24小時(shí)后肝功能，肝臟ICAM-l、Nf-kB和AP-1活性的表達(dá)。 結(jié)果小鼠膿毒癥模型的建立過程規(guī)范，操作簡(jiǎn)單，具有可重復(fù)性，且

13、模型的檢測(cè)指標(biāo)明確。CLP術(shù)后24h小鼠肝臟微血管通透性明顯增高，肝細(xì)胞明顯腫脹，胞漿疏松，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，竇腔內(nèi)有中性粒細(xì)胞聚集，門脈區(qū)有較多中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；肝功能損害較重，血清中ALT含量升高；血清細(xì)胞因子TNF-a、IL-1B表達(dá)明顯增加，肝組織ICAM-l的表達(dá)明顯增加，AP-l、NF-kB蛋自表達(dá)明顯增加。外源性CO的直接干預(yù)可以明顯抑制炎性反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞。 結(jié)論本膿毒癥模型在機(jī)體損傷，肝臟的損傷方面達(dá)到了預(yù)期的要求。