MICA在NK細胞殺傷胰腺癌中的作用以及吉西他濱對胰腺癌細胞MICA蛋白脫落的影響.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分、MICA及NK細胞活化性受體NKG2D在胰腺癌表達和臨床意義
　　 目的：
　　 探討MICA及NK細胞活化性受體NKG2D在胰腺癌表達和臨床意義。
　　 方法：
　　 RT-PCR技術(shù)檢測10例胰腺癌、6例慢性胰腺炎和6例正常胰腺組織中MICA mRNA水平。免疫組化技術(shù)檢測64例胰腺癌、13例慢性胰腺炎和11例正常胰腺組織中MICA的表達。ELISA和流式細

2、胞術(shù)分別檢測53例胰腺癌，7例慢性胰腺炎和20例健康志愿者血清中可溶性MICA(sMICA)水平和外周血中NK細胞受體NKG2D的表達。
　　 結(jié)果：
　　 1.胰腺癌組織MICA mRNA表達水平顯著高于慢性胰腺炎和正常胰腺組織(P＜0.01)。
　　 2.免疫組化顯示胰腺癌組織中MICA陽性表達率為89.1％，顯著高于慢性胰腺炎和正常胰腺組織(P＜0.01)。MICA表達強度與胰腺癌分化程度、遠處轉(zhuǎn)移和臨床分

3、期密切相關(guān)(P＝0.042,0.028,0.003)；MICA高表達的胰腺癌患者預(yù)后較好(P＝0.019)。
　　 3.胰腺癌患者血清sMICA水平顯著高于健康志愿者和慢性胰腺炎患者(P＜0.01)，Ⅲ/Ⅳ期胰腺癌患者血清sMICA水平高于Ⅰ/Ⅱ期患者(P＜0.01)，有遠處轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者血清sMICA水平較無轉(zhuǎn)移患者明顯增高(P＜0.01)。
　　 4.sMICA陽性胰腺癌患者外周血中NK細胞受體NKG2D的表達強度

4、明顯低于健康志愿者、慢性胰腺炎患者和sMICA陰性胰腺癌患者(P＜0.01)。胰腺癌患者外周血中NK細胞受體NKG2D表達強度與血清sMICA水平呈顯著負相關(guān)(P＜0.01)。
　　 5.胰腺癌根治性切除可以下調(diào)患者血清sMICA水平和上調(diào)NK細胞受體NKG2D的表達。
　　 結(jié)論：
　　 MICA作為免疫監(jiān)視分子在早期胰腺癌組織中廣泛表達，隨著胰腺癌進展，MICA從胰腺癌細胞表面脫落形成sMICA，血清中sMI

5、CA含量增高可能導(dǎo)致了NK細胞受體NKG2D表達的下調(diào)。胰腺癌根治性切除可以下調(diào)患者血清sMICA水平和上調(diào)NK細胞受體NKG2D的表達。
　　 第二部分、MICA在NK細胞殺傷人胰腺癌PANC-1細胞中的作用
　　 目的：
　　 探討MICA在NK細胞殺傷人胰腺癌PANC-1細胞中的作用。
　　 方法：
　　 應(yīng)用NK細胞分選試劑盒從外周血中負向分選高純度NK細胞用于實驗。體外培養(yǎng)人胰腺癌PAN

6、C-1細胞和人NK細胞，應(yīng)用抗體封閉法，觀察NKG2D與膜型MICA識別在NK細胞殺傷PANC-1細胞中的作用。將正常NK細胞在含有sMICA陽性胰腺癌患者血清的培基中培養(yǎng)，觀察NK細胞受體NKG2D的表達以及NK細胞對PANC-1細胞的殺傷作用。
　　 結(jié)果：
　　 1.經(jīng)MICA或NKG2D抗體封閉后，NK細胞的殺瘤活性較封閉前顯著減弱(P＜0.01)。
　　 2.胰腺癌患者血清中的sMICA可以下調(diào)NK細胞

7、受體NKG2D的表達，并降低NK細胞對PANC-1細胞的殺傷活性。
　　 結(jié)論：
　　 NKG2D與膜型MICA識別在NK細胞殺傷人胰腺癌PANC-1細胞中起重要作用。sMICA是造成胰腺癌免疫逃逸的重要分子機制之一。
　　 第三部分、ADAM10在人胰腺癌PANC-1細胞MICA蛋白脫落過程中的作用以及吉西他濱對MICA蛋白脫落的影響
　　 目的：
　　 探討ADAM10在PANC-1細胞MIC

8、A蛋白脫落過程中的作用，觀察吉西他濱對MICA蛋白脫落的影響并探討可能的作用機制。
　　 方法：
　　 免疫組化檢測64例胰腺癌和11例正常胰腺組織ADAM10的表達情況。通過化學(xué)合成的小分子干擾RNA(siRNA)下調(diào)PANC-1細胞ADAM10表達后，流式細胞術(shù)和ELISA分別檢測細胞表面MICA的表達強度和細胞上清中sMICA的含量。采用MTT法檢測不同濃度吉西他濱對PANC-1細胞增殖的影響。選擇濃度為5ng/m

9、l的吉西他濱作用PANC-1細胞24小時，RT-PCR和Western blot檢測細胞中ADAM10 mRNA和蛋白表達水平，同時用RT-PCR、流式細胞術(shù)和ELISA分別檢測MICA mRNA、細胞表面MICA的表達強度和細胞上清中sMICA的含量。先用ADAM10 siRNA或陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染PANC-1細胞，轉(zhuǎn)染24小時后，再加入吉西他濱（對照組加等體積培基）繼續(xù)培養(yǎng)24小時，流式細胞術(shù)和ELISA分別檢測細胞表面MICA

10、的表達強度和細胞上清中sMICA的含量。
　　 結(jié)果：
　　 1.ADAM10在胰腺癌組織中陽性表達率(87.5％)顯著高于正常胰腺組織(P＜0.01)。
　　 2.下調(diào)ADAM10表達后，PANC-1細胞表面MICA表達增強，而細胞上清液中sMICA的含量減少(P＜0.01)。
　　 3.當培基中濃度小于7ng/ml時，吉西他濱在24小時內(nèi)對PANC-1細胞增殖無明顯影響(P＞0.05)。
　　

11、 4.吉西他濱顯著下調(diào)PANC-1細胞ADAM10 mRNA和蛋白的表達水平(P＜0.01)。
　　 5.吉西他濱(5ng/ml)作用PANC-1細胞24小時后，細胞表面MICA表達增強，細胞上清液中sMICA的含量減少(P＜0.01)。吉西他濱對PANC-1細胞MICA mRNA表達無明顯影響。
　　 6.siRNA下調(diào)ADAM10表達后，吉西他濱對PANC-1細胞表面MICA蛋白的表達和上清液中sMICA的含量無明顯