不同血清型肺炎鏈球菌LytA基因的克隆、表達(dá)及免疫學(xué)研究.pdf

1、研究目的構(gòu)建肺炎鏈球菌常見致病血清型19F、14、6A、23F及6B菌株以及北京標(biāo)準(zhǔn)株31108的LytA基因的原核重組質(zhì)粒,運用生物信息學(xué)方法對其核苷酸及推測的氨基酸序列進(jìn)行分析,了解不同血清型LytA基因核苷酸及氨基酸序列間的異同及遺傳關(guān)系.進(jìn)行原核重組表達(dá),利用Western Blot分析對其抗原性進(jìn)行初步研究,為開發(fā)肺炎鏈球菌疫苗及新藥奠定基礎(chǔ).研究方法(1)藥物敏感性實驗:運用紙片法和青霉素E-test檢測所收集的19F、14

2、、6A、23F和6B血清型肺炎鏈球菌以及肺炎鏈球菌北京標(biāo)準(zhǔn)株31108的耐藥情況.(2)LytA基因的克隆:分別提取以上6株不同血清型肺炎鏈球菌的基因組DNA.根據(jù)已知肺炎鏈球菌野生R6株LytA基因序列設(shè)計引物,進(jìn)行PCR擴增,將獲得的目的基因片段克隆入原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1.雙酶切和測序?qū)χ亟M質(zhì)粒進(jìn)行鑒定.(3)不同血清型LytA基因的序列分析:利用生物信息學(xué)工具進(jìn)行LytA基因的DNA及推測蛋白質(zhì)序列的分析、比對.并對推測

3、的蛋白分子的高級結(jié)構(gòu)及可能的功能位點進(jìn)行預(yù)測.(4)LytA基因的重組表達(dá)及純化:誘導(dǎo)表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-LytA,對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析.利用GSTrap.FF親合層析柱和Thrombin,獲得純化重組LytA蛋白.(5)重組LytA的質(zhì)譜分析:利用基體輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF MS)對所獲得純化蛋白產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定.(6)重組蛋白的免疫學(xué)研究:分別用肺炎鏈球菌血清型19F的Ly

4、tA融合蛋白凝膠-PBS懸液和菌液免疫大鼠,獲得血清,雙向免疫擴散試驗和直接凝集反應(yīng)(試管法)實驗進(jìn)行驗證.Western Blot分析重組LytA蛋白分子的抗原性;交叉Western Blot分析不同血清型間重組LytA蛋白抗原性的異同.小結(jié)藥物敏感性實驗證明我們所研究的5株國內(nèi)常見致病血清型的肺炎鏈球菌菌株均為多重耐藥株及青霉素低度耐藥株.從不同血清型肺炎鏈球菌基因組DNA中均擴增出了LytA基因序列,成功構(gòu)建了6個重組質(zhì)粒pGEX