不同血清型肺炎鏈球菌LytA基因的克隆、表達及免疫學研究.pdf

1、研究目的構建肺炎鏈球菌常見致病血清型19F、14、6A、23F及6B菌株以及北京標準株31108的LytA基因的原核重組質粒,運用生物信息學方法對其核苷酸及推測的氨基酸序列進行分析,了解不同血清型LytA基因核苷酸及氨基酸序列間的異同及遺傳關系.進行原核重組表達,利用Western Blot分析對其抗原性進行初步研究,為開發(fā)肺炎鏈球菌疫苗及新藥奠定基礎.研究方法(1)藥物敏感性實驗:運用紙片法和青霉素E-test檢測所收集的19F、14

2、、6A、23F和6B血清型肺炎鏈球菌以及肺炎鏈球菌北京標準株31108的耐藥情況.(2)LytA基因的克隆:分別提取以上6株不同血清型肺炎鏈球菌的基因組DNA.根據(jù)已知肺炎鏈球菌野生R6株LytA基因序列設計引物,進行PCR擴增,將獲得的目的基因片段克隆入原核表達質粒pGEX-4T-1.雙酶切和測序對重組質粒進行鑒定.(3)不同血清型LytA基因的序列分析:利用生物信息學工具進行LytA基因的DNA及推測蛋白質序列的分析、比對.并對推測

3、的蛋白分子的高級結構及可能的功能位點進行預測.(4)LytA基因的重組表達及純化:誘導表達重組質粒pGEX-4T-1-LytA,對表達產物進行SDS-PAGE電泳分析.利用GSTrap.FF親合層析柱和Thrombin,獲得純化重組LytA蛋白.(5)重組LytA的質譜分析:利用基體輔助激光解析飛行時間質譜技術(MALDI-TOF MS)對所獲得純化蛋白產物進行進一步的鑒定.(6)重組蛋白的免疫學研究:分別用肺炎鏈球菌血清型19F的Ly

4、tA融合蛋白凝膠-PBS懸液和菌液免疫大鼠,獲得血清,雙向免疫擴散試驗和直接凝集反應(試管法)實驗進行驗證.Western Blot分析重組LytA蛋白分子的抗原性;交叉Western Blot分析不同血清型間重組LytA蛋白抗原性的異同.小結藥物敏感性實驗證明我們所研究的5株國內常見致病血清型的肺炎鏈球菌菌株均為多重耐藥株及青霉素低度耐藥株.從不同血清型肺炎鏈球菌基因組DNA中均擴增出了LytA基因序列,成功構建了6個重組質粒pGEX