VEGF基因修飾血管內(nèi)皮祖細(xì)胞聯(lián)合基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α治療下肢缺血的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、在血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)誘導(dǎo)的血管生成中，骨髓來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)的募集和捕獲起著關(guān)鍵作用。EPCs的動(dòng)員和分化被另一個(gè)重要的趨化因子——基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(Stromal cell—derived factor-1α，SDF-1α/CXCL12)所調(diào)控。因此我們?cè)O(shè)想在由EPCs介導(dǎo)的血管發(fā)生過(guò)

2、程中，如果結(jié)合SDF-1α和VEGF的作用，可能會(huì)有助于增加新生血管生成通路。我們的研究首次將VEGF165基因修飾的EPCs和SDF-1α聯(lián)合應(yīng)用于后肢缺血小鼠的治療。通過(guò)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)提出了二者存在協(xié)同作用的可能性，為臨床缺血性疾病的治療拓開了思路。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)明確了VEGF165的高表達(dá)能促進(jìn)SDF-1α介導(dǎo)的EPCs的遷移，而SDF-1α又能顯著抑制人VEGF165基因修飾的EPCs(hVEGF165-EPCs)的凋亡；通過(guò)動(dòng)物

3、實(shí)驗(yàn)證實(shí)了聯(lián)合hVEGF165-EPCs和SDF-1α能改善血管生成的微環(huán)境，促進(jìn)微血管生成，增加缺血組織血流灌注；初步探討了hVEGF165-EPCs和SDF-1α聯(lián)合治療的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)從mRNA水平證實(shí)VEGF上調(diào)EPCs的CXCR—4表達(dá)，而阻斷CXCR—4能抵消SDF-1α所介導(dǎo)的hVEGF165-EPCs的遷移，表明VEGF通過(guò)上調(diào)CXCR—4表達(dá)促進(jìn)SDF-1α介導(dǎo)的EPCs遷移。 本研究表明，在EPCs誘導(dǎo)的新生

4、血管形成中，SDF-1α和VEGF可能存在的協(xié)同生血管通路機(jī)制至關(guān)重要，針對(duì)VEGF和SDF-1α信號(hào)的共同靶點(diǎn)可能為缺血性疾病的治療提供一種新的、更為有效的策略。 1.人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)、擴(kuò)增和鑒定 采用密度梯度離心法分離出成人外周血中的單個(gè)核細(xì)胞(Human peripheral blood mononuclear cells，hPBMCs)，將細(xì)胞接種在纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)包被的

5、培養(yǎng)板中，用內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)基(EndoCultTM液體培養(yǎng)基)誘導(dǎo)培養(yǎng)。2天后，收集懸浮細(xì)胞重新接種至包被了FN的培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)3天。 培養(yǎng)5天的細(xì)胞內(nèi)吞乙?；兔芏戎鞍?acetylated low density lipoprotein，ac—LDL)結(jié)合荊豆凝集素-1(Ulex europaeus agglutinin，UEA-1)，顯示雙陽(yáng)性；內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物Ⅷ因子相關(guān)抗原(von Willebrand factor

6、，VWF)陽(yáng)性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)，CD133+細(xì)胞率為67.82±0.54％。 2.VEGF165基因逆轉(zhuǎn)錄病毒感染人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞 將重組質(zhì)粒擴(kuò)增、純化，轉(zhuǎn)染293-GPG(VSV—G)病毒包裝細(xì)胞，獲取攜帶pBABE—VEGF165的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(Td/V)。用逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液感染EPCs?；旌细腥疽号囵B(yǎng)3h后，PBS輕柔清洗，加入EPCs培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，待用。 為衡量感染效果，將轉(zhuǎn)入了VEGF165基因

7、的EPCs植入裸鼠體內(nèi)，觀察裸鼠體內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的血漿VEGF165濃度水平。 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)顯示，靜脈注入TdN—EPCs的裸鼠外周血VEGF165濃度在不同時(shí)間點(diǎn)都高于空載體組(Td/p—EPCs)。 3.SDF-1α影響人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移、凋亡的體外實(shí)驗(yàn) EPCs的遷移是血管新生的關(guān)鍵步驟。本研究中，我們通過(guò)體外Transwell實(shí)驗(yàn)觀察了VEGF和SDF-1α促使的EPCs遷移。在

8、Transwell板下室加入EndoCultTM全培養(yǎng)液，添加0.1％BSA；按實(shí)驗(yàn)分組，在下室中加或不加SDF-1α(100ng/ml)，使下室液體終容積為30μl；分別收集EPCs，Td/p—EPCs和Td/V—EPCs制備細(xì)胞懸液，用50μl EndoCultTM全培養(yǎng)液(添加0.1％BSA)重懸細(xì)胞加入Transwell小室。 為阻斷CXCR—4受體通路，Td/V—EPCs預(yù)先加入CXCR—4特異性拮抗劑AMD3100(

9、5μg/ml)，37℃孵育30min。 研究顯示各組細(xì)胞中，添加了SDF-1α的細(xì)胞遷移能力明顯強(qiáng)于未添加孔，而在添加了SDF-1α的細(xì)胞組中，細(xì)胞遷移能力Td/N—EPCs明顯強(qiáng)于Td/p—EPCs和EPCs。VEGF和SDF-1α促使的EPCs遷移可被CXCR—4特異性拮抗劑AMD3100抵消。 Td/V—EPCs同Td/p—EPCs、EPCs間CXCR—4在mRNA水平上的表達(dá)存在顯著性差異，TdN—EPCs的C

10、XCR—4mRNA表達(dá)水平高于Td/p—EPCs和EPCs。 EPCs的存活對(duì)保持穩(wěn)定的新生血管形成至關(guān)重要。我們采用饑餓誘導(dǎo)凋亡(3％FBS EndoCultTM液體培養(yǎng)基)的方法，觀察VEGF和SDF-1α是否能協(xié)同促進(jìn)EPCs的存活。AnnexinV—FITC/PI雙染法檢測(cè)凋亡細(xì)胞百分率。 結(jié)果顯示，單一因素SDF-1α或Td/V—EPCs組同各自對(duì)照組(EPCs或Td/p—EPCs)的細(xì)胞凋亡比率存在顯著性差

11、異(P<0.01)，前者降低凋亡比率；雙因素TdN—EPCs+SDF-1α組分別同單一因素SDF-1α組及Td/V—EPCs組的細(xì)胞凋亡比率存在顯著性差異(P<0.001)，Td/V—EPCs+SDF-1α組減少細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雙因素VEGF和SDF-1α的存在，能最大限度的降低細(xì)胞凋亡比率。 VEGF和SDF-1α能促進(jìn)EPCs遷移能力，減少EPCs的凋亡。VEGF和SDF-1α的協(xié)同作用可能存在多重機(jī)制。隨著研究的

12、不斷進(jìn)展，在眾多參與血管生成調(diào)控過(guò)程的趨化因子中，VEGF、SDF-1/CXCR—4軸在血管新生等方面的重要作用將越來(lái)越被人們所關(guān)注。 4.SDF-1α聯(lián)合VEGF165修飾的人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞治療小鼠后肢缺血的研究 實(shí)驗(yàn)選用BALB/C—nu/nu雌性裸鼠，8～10周齡，體重17～22g。10％水合氯醛腹腔注射麻醉，外科手術(shù)顯微鏡下分離結(jié)扎股動(dòng)脈及各分支。結(jié)扎近、遠(yuǎn)端股動(dòng)脈并切斷，注意必須結(jié)扎并切斷股深動(dòng)脈。彩色激光多

13、普勒血流灌注成像儀(Laser Doppler perfusion imaging，LDPI)檢測(cè)裸鼠后肢血流。血流灌注量數(shù)值從低到高分別由不同的顏色表示，紅色區(qū)域表示為最大血流灌注，黃色為中等量血流灌注，藍(lán)色表示較低的血流灌注。獲取的數(shù)碼圖像記錄了檢測(cè)區(qū)域的血流灌注量絕對(duì)值(readable units，RU)。按實(shí)驗(yàn)分組給藥治療。 示蹤：CM—Dil標(biāo)記細(xì)胞。處死裸鼠前30min，經(jīng)尾靜脈注入FITC標(biāo)記的BS-1(Band

14、eiraea simplicifolia lectin-1)。熒光顯微鏡下，顯示紅色熒光的為EPCs，裸鼠微血管內(nèi)皮顯示綠色熒光。 結(jié)果顯示：聯(lián)合治療組(肌注SDF-1α，靜注Td/V—EPCs)患肢腓腸肌切片微血管密度與其他各組存在顯著性差異，聯(lián)合治療組微血管密度高于其他各組。對(duì)募集到患肢的EPCs和裸鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞定量分析顯示，不論是EPCs還是裸鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞密度，聯(lián)合治療組均高于其他各組。 LDPI采集每組

15、裸鼠患肢和健肢的RU(readable units，RU)比值，取平均值。結(jié)果顯示聯(lián)合治療組患肢RU比值與其他各組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)存在顯著性差異，聯(lián)合治療組患肢RU比值高于其他各組。 在這部分實(shí)驗(yàn)中，我們首先制作了裸鼠后肢缺血模型，然后利用如前所述培養(yǎng)的EPCs及VEGF165基因修飾的EPCs行靜脈移植，同時(shí)局部肌肉注射SDF-1α，觀察裸鼠新生血管形成和側(cè)枝循環(huán)的建立情況。我們首次證實(shí)經(jīng)靜脈移植過(guò)表達(dá)hVEGF165的EPCs聯(lián)

16、合局部肌肉注射SDF-1α，對(duì)局部組織缺血的治療效果要優(yōu)于單一因素。研究證實(shí)，通過(guò)聯(lián)合治療，能促進(jìn)EPCs的動(dòng)員、內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和更顯著的血管形成反應(yīng)、減少組織損害，增加缺血后肢功能。 總之，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，聯(lián)合SDF-1α和靜脈移植過(guò)表達(dá)VEGF165的EPCs治療缺血性疾病，其效果優(yōu)于任一單一治療。本研究表明，在EPCs誘導(dǎo)的新生血管形成中，SDF-1α和VEGF可能存在的協(xié)同生血管通路機(jī)制至關(guān)重要，針對(duì)VEGF和SDF