秀珍菇變溫結實相關Ppcsl-1基因的克隆及表達分析.pdf

1、出菇結實(fruiting-body forming)是食用菌繁殖后代的重要生命現(xiàn)象。食用菌的出菇受溫度、濕度、光照和二氧化碳濃度等環(huán)境因素的深刻影響。一些食用菌必需受低溫刺激才能使成熟菌絲從營養(yǎng)期轉向繁殖期，這種獨特轉變稱為“變溫結實”。該特殊生物學現(xiàn)象，已經(jīng)被廣泛應用于食用菌的生產(chǎn)實踐中，但是其分子機制尚不清楚。
　　秀珍菇（Pleurotus pulmonarius）又名袖珍菇、肺形側耳、鳳尾菇等，隸屬真菌門、擔子菌綱、傘菌

2、目、側耳科、側耳屬。“農(nóng)秀1號”是浙江省農(nóng)科院通過雜交選育獲得的秀珍菇高溫型新品系，其具有典型短暫冷刺激誘導子實體形成的特點，是研究食用菌變溫結實的理想材料。前期研究獲得了秀珍菇變溫結實相關的消減雜交文庫，發(fā)現(xiàn)變溫結實過程不僅涉及到下游代謝途徑相關基因和細胞形態(tài)結構相關基因的表達水平變化，而且涉及到上游多個甚至全局性調控基因的表達變化。其中轉錄因子在這一重要的生命進程中扮演關鍵角色。因而轉錄因子的克隆和功能鑒定將會為食用菌變溫結實分子機

3、制的研究提供重要線索。
　　本研究已從該文庫中篩選獲得一個相關csl因(屬于CSL(CBF1/RBP-Jκ/Suppressor of Hairless/LAG-1)轉錄因子家族）EST序列，結合前人報道，該基因可能參與秀珍菇發(fā)育、細胞分化及細胞粘附，是具有重要意義的轉錄因子基因。本研究將通過克隆分析該基因，希望能夠為變溫結實這一復雜過程的分子機制的闡明奠定基礎。
　　本研究通過TAIL PCR技術克隆了秀珍菇csl基因（P

4、leurotus pulmonariuscsl-1，簡寫為pcsl-1），Ppcsl-1基因由4個外顯子和3個內含子組成。利用RACE技術獲得該基因的eDNA全長。Ppcsl-1基因的CDS序列全長2991bp，編碼一個996氨基酸組成的蛋白（命名為PpCSL-1）。PpCSL-1含有LAG1、BTD和IPT三個結構域，其DNA結合位點非常保守。PpCSL-1為親水性蛋白，但包含一個明顯的疏水結構，該疏水結構位于BTD結構域，說明該蛋白

5、可能是跨膜蛋白或者可與膜結合的一類蛋白。選擇30個真菌和后生動物的CSL，構建了CSL的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，并對這些CSL的結構域進行了比較分析，分析顯示CSL在進化過程中結構域和DNA結合位點都比較保守。進化分析顯示，在擔子菌CSL中，PpCSL-1與糙皮側耳JPleurotus ostreatus CSL(PoCSL)親緣關系最近。通過熒光定量技術和geNorm軟件對ACT、GAPDH、eIF5、TUA、ATPase、RPL14等6個管

6、家基因在秀珍菇不同生長發(fā)育時期的表達穩(wěn)定性進行評價，結果表明，這些基因的表達穩(wěn)定性平均值M分布在0.496至1.025之間，分別為RPL14(0.496)＞ATPase(0.536)＞eIF5(0.551)＞ACT(0.702)＞TUA(0.717)＞GAPDH(1.025)，其中RPL14的M值最低，說明其表達最穩(wěn)定。以RPL14基因作參考基因，熒光定量檢測Ppcsl-1基因在營養(yǎng)菌絲期、冷處理12h、原基期、珊瑚期和子實體期等不同發(fā)