鵪鶉α、γ干擾素克隆、原核表達(dá)及抗病毒活性分析.pdf

1、鵪鶉是我國重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，養(yǎng)殖量位居世界首位，然而某些烈性傳染病如新城疫、禽流感等嚴(yán)重威脅著鵪鶉養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。干擾素可以干擾病毒粒子復(fù)制，保護(hù)細(xì)胞不受病毒感染，具有良好的抗病毒、免疫調(diào)節(jié)功能，是理想的抗病毒生物制劑。
　　本研究利用PCR技術(shù)從鵪鶉全基因組克隆IFN-α基因片段，并從刀豆素A誘導(dǎo)培養(yǎng)的鵪鶉外周血淋巴細(xì)胞中提取RNA，利用RT-PCR技術(shù)得到鵪鶉IFN-γ cDNA，PCR擴(kuò)增IFN-γ基因片段。分別構(gòu)建pEASY-

2、Blunt-coIFN-α、pEASY-Blunt-coIFN-γ克隆載體，測序表明coIFN-α開放閱讀框大小為594 bp，編碼197 aa; coIFN-γ開放閱讀框大小為495 bp，編碼164 aa。構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-32a-coIFN-α、pET-32a-coIFN-γ，并在大腸桿菌系統(tǒng)中誘導(dǎo)表達(dá)。丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果表明coIFN-α和coIFN-γ重組蛋白大小約為43.0 kDa和40.0 kDa，均存在于包涵體中

3、。將coIFN-α和coIFN-γ重組蛋白純化、復(fù)性，利用純化蛋白制備兔抗coIFN-α、coIFN-γ多克隆抗體。用復(fù)性后的coIFN-α和coIFN-γ重組蛋白孵育雞胚成纖維細(xì)胞，分別接種新城疫、禽流感、水泡性口炎病毒，檢測coIFN-α、coIFN-γ重組蛋白抗病毒活性。結(jié)果表明:coIFN-α、coIFN-γ抗病毒生物活性最高達(dá)到104 U/mg、103-104 U/mg級別。coIFN-α、coIFN-γ重組蛋白被兔抗coIF