四硫代鉬酸銨增強順鉑抗食管鱗癌的作用及其分子機制.pdf

1、目的：
　　食管癌是最常見的消化道腫瘤之一，其發(fā)生率在全球范圍內(nèi)居第八位，死亡率占第六位。根據(jù)組織學(xué)類型，食管癌主要分為食管鱗癌(esophagealsquamous cell carcinoma，ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma，EAC)。在中國，食管鱗癌作為主要的組織學(xué)類型其致死性高，預(yù)后差，5年生存率低，并具有明顯的地域分布差異。目前食管鱗癌的主要治療手段包括手術(shù)、放療、化療等，對于晚

2、期與轉(zhuǎn)移性的食管鱗癌患者，化療仍然是延長患者生存期與改善患者預(yù)后最主要的治療手段，但耐藥性和毒性是導(dǎo)致化療失敗的主要原因，因此尋找一種新的有效的預(yù)防、診斷和治療食管鱗癌患者的策略顯得越來越重要。
　　四硫代鉬酸銨(ammonium tetrathiomolybdate，TM)是人類所必須的微量元素鉬的化合物之一，可以與銅離子、血液中的清蛋白形成高親和力的三元復(fù)合物，能螯合血液中游離的銅離子，降低體內(nèi)銅的含量。在多種腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)，

3、TM具有減少血管生成、抑制腫瘤生長和遠端轉(zhuǎn)移、促進腫瘤壞死等作用。研究表明，TM通過靶向銅轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白增強婦科腫瘤（如乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌等）對順鉑的敏感性，減少化療中產(chǎn)生的耐藥性，進一步提高其抗腫瘤效果。順鉑是目前臨床上用于治療多種惡性腫瘤最廣泛的一線標準化療藥物，包括宮頸癌、卵巢癌、頭頸部癌、肺癌、胃腸道癌、乳腺癌、食管癌等。然而，順鉑產(chǎn)生的副作用及神經(jīng)毒性，使其使用劑量與藥效都受到了嚴重的限制，因而如何降低其治療劑量并增強其抗腫

4、瘤效果以及闡明其耐藥的分子機制成為目前研究的熱點。
　　研究表明，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(Signal transducers and activators of transcription3，Stat3)信號途徑參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，并成為腫瘤有效的治療靶點。后來陸續(xù)的研究顯示，Stat3信號途徑與多種腫瘤的耐藥關(guān)系密切，該途徑的活化是介導(dǎo)腫瘤耐藥極其重要的信號途徑之一。是否TM聯(lián)合順鉑發(fā)揮抗腫瘤作用與Stat3信號途徑

5、的活化有關(guān)？這將成為本課題探討的方向。因此，本課題首先通過細胞增殖實驗、流式細胞術(shù)、遷移和侵襲相關(guān)實驗以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)闡明TM在食管鱗癌中的抗腫瘤作用及其可能的分子機制;進一步探討將TM與順鉑聯(lián)合的協(xié)同抗腫瘤作用及其分子機制。該研究為TM在未來臨床上治療食管鱗癌患者奠定理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　第一部分 四硫代鉬酸銨體外抗食管鱗癌細胞的作用及其分子機制
　　1.CCK-8實驗檢測不同濃度的TM(0、5、10、20、30、

6、50、80、100、150和200μM)，在不同時間點（24、48、72和96h）對食管鱗癌細胞(EC1、Eca109、EC9706、TE1)增殖能力的影響。
　　2.采用流式細胞術(shù)分別檢測不同濃度的TM在48h對食管鱗癌細胞周期和凋亡的影響。Hoechst染色檢測不同濃度的TM在48h對食管鱗癌細胞凋亡的影響。
　　3.細胞劃痕和Transwell小室檢測不同濃度的TM對食管鱗癌細胞遷移和侵襲能力的影響。
　　4.A

7、ffymetrix基因芯片表達譜分析TM對食管鱗癌細胞Eca109轉(zhuǎn)錄表達譜的影響。Western blot檢測不同濃度的TM在48h對食管鱗癌細胞周期、凋亡和侵襲相關(guān)蛋白水平的表達變化，同時驗證芯片表達結(jié)果中關(guān)鍵的非受體酪氨酸激酶c-Abl的表達變化。
　　5.統(tǒng)計學(xué)處理:實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism6.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析處理。對于多個樣本采用One-way ANOVA分析，兩個樣本采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05

8、表示具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　第二部分 四硫代鉬酸銨通過抑制Stat3途徑增強食管鱗癌細胞對順鉑的敏感性
　　1.CCK-8實驗檢測不同濃度的順鉑（0、0.5、1、2、5、8、10、20和50μg/ml）在不同時間點（24h、48h、72h和96h）對食管鱗癌細胞(EC1、Eca109、EC9706和TE1)增殖能力的影響;以及TM聯(lián)合不同濃度的順鉑（0、1、2、5和10μg/ml）對食管鱗癌細胞增殖活性的影響。
　　2.

9、流式細胞術(shù)和Transwell小室分別檢測TM聯(lián)合順鉑在48h對食管鱗癌細胞凋亡和侵襲能力的影響。
　　3.Western blot檢測TM聯(lián)合順鉑以及TM、順鉑和IL-6共同處理食管鱗癌細胞48h，Star3和p-Stat3蛋白表達水平的變化。并且采用CCK-8實驗檢測TM/順鉑/IL-6共同處理對食管鱗癌細胞增殖能力的影響。
　　4.裸鼠移植瘤實驗:皮下接種食管鱗癌細胞EC9706，設(shè)生理鹽水組、單獨TM治療組、單獨順鉑

10、治療組和TM聯(lián)合順鉑治療組，每周2次測定腫瘤體積，并采用GraphPad Prism6.0軟件匯制腫瘤生長曲線。當測量結(jié)束后，剝離腫瘤組織，做石蠟包埋組織切片，采用免疫組織化學(xué)檢測血管生成相關(guān)蛋白VEGF、CD31和ERG的表達以及總的Stat3、p-Stat3和Ki-67的表達。
　　5.統(tǒng)計學(xué)處理:實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism6.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析處理，對于多個樣本采用One-way ANOVA分析，兩個樣本采用

11、獨立樣本t檢驗，P＜0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　第一部分
　　1.CCK-8結(jié)果表明，不同濃度的TM均能抑制食管鱗癌細胞的增殖活性，隨時間的延長，抑制效果越明顯。
　　2.細胞周期結(jié)果表明，不同濃度的TM均能阻滯食管鱗癌細胞周期在S期;Western blot結(jié)果顯示，TM顯著下調(diào)食管鱗癌細胞中細胞周期蛋白依賴性激酶CDK4與細胞周期素Cyclin D1、Cyclin A蛋白的表達水平。

12、　　3.細胞凋亡結(jié)果表明，不同濃度的TM均能顯著增加食管鱗癌細胞凋亡的細胞數(shù)，且TM濃度越大，凋亡細胞數(shù)越多;進一步Hoechst染色結(jié)果顯示，TM能夠誘導(dǎo)食管鱗癌細胞凋亡。此外，Western blot結(jié)果顯示，TM顯著促進食管鱗癌細胞中細胞凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase3、p-PARP和促凋亡蛋白Bax的表達，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達。
　　4.在48h和72h，不同濃度的TM均能顯著抑制食管鱗癌細胞的遷移;此

13、外，Transwell小室結(jié)果表明，不同濃度的TM能顯著抑制食管鱗癌細胞的侵襲能力。Western blot結(jié)果表明，TM顯著下調(diào)食管鱗癌細胞中金屬基質(zhì)蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達。
　　5.Affymetrix基因芯片表達譜結(jié)果顯示，TM能夠激活或抑制食管鱗癌Eca109細胞中多種信號途徑，其中包括下調(diào)Eca109細胞中c-Abl基因mRNA的水平;Western blot實驗進一步證實不同濃度的TM均能顯著下調(diào)食管鱗癌細

14、胞中c-Abl蛋白的表達。
　　第二部分
　　1.CCK-8結(jié)果顯示，不同濃度的順鉑均能顯著抑制食管鱗癌細胞的增殖活性，隨時間的延長，其抑制效果逐漸增加;TM能顯著增強順鉑對食管鱗癌細胞增殖的抑制效果。
　　2.流式細胞術(shù)結(jié)果表明，與未處理組或單獨處理組相比，TM聯(lián)合順鉑能顯著誘導(dǎo)食管鱗癌細胞凋亡;Transwell小室結(jié)果顯示，與未處理組或單獨處理組相比，TM聯(lián)合順鉑顯著抑制食管鱗癌細胞的侵襲能力。
　　3.W

15、estem blot結(jié)果表明，TM聯(lián)合順鉑顯著下調(diào)食管鱗癌細胞中p-Star3蛋白的表達水平，而對總的Stat3的蛋白表達無影響。IL-6能夠逆轉(zhuǎn)TM聯(lián)合順鉑組中食管鱗癌細胞中p-Stat3蛋白表達的降低，進一步的CCK-8實驗結(jié)果表明，IL-6介導(dǎo)的Stat3的活化能夠逆轉(zhuǎn)TM聯(lián)合順鉑介導(dǎo)的食管鱗癌細胞的抑制效應(yīng)。
　　4.裸鼠皮下移植瘤實驗顯示，與生理鹽水組、單獨TM治療組、單獨順鉑治療組相比，TM聯(lián)合順鉑治療顯著抑制裸鼠移植

16、瘤的生長。免疫組織化學(xué)結(jié)果表明，TM聯(lián)合順鉑治療能降低腫瘤組織中血管生成相關(guān)蛋白VEGF、CD31和ERG的表達水平，并抑制p-Stat3的活化，降低Ki-67的表達。
　　結(jié)論：
　　1.TM能引發(fā)食管鱗癌細胞的增殖抑制、S期阻滯、細胞凋亡以及遷移和侵襲能力的降低，表明TM可能成為抗食管鱗癌潛在的治療制劑。
　　2.TM能從體內(nèi)外增強順鉑的抗腫瘤效果，提示TM有望成為臨床上順鉑治療食管鱗癌患者的輔助藥物。