IBV感染雞腎臟和脾臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析及雞IFITM1抑制IBV和NDV復(fù)制機(jī)制的研究.pdf

1、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)和新城疫病毒(NDV)是危害養(yǎng)禽業(yè)的重要病原，二者引起急性、高度傳染性禽呼吸道疾病，威脅著養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。
　　本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析了IBV感染后宿主脾臟和腎臟中全基因的差異表達(dá)情況，借以嘗試揭示IBV的致病機(jī)制和宿主的抗病毒機(jī)制。我們比較分析了IBV感染早期和晚期脾臟基因差異表達(dá)情況。結(jié)果表明脾臟作為重要免疫器官參與了宿主對(duì)IBV的免疫反應(yīng)，在IBV感染早期激發(fā)的免疫反應(yīng)要強(qiáng)于感染晚期，IBV感染晚

2、期誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)要強(qiáng)于感染早期。在IBV感染致死雞的腎臟中共有1777個(gè)差異表達(dá)基因;其中包括干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白1(IFITM1)在內(nèi)的103個(gè)免疫和炎癥相關(guān)基因顯著差異表達(dá)這103個(gè)免疫和炎癥相關(guān)基因能夠組成一個(gè)以IL6，STAT1，MYD88，IRF1和NFKB2為中心的相互作用網(wǎng)絡(luò)。提示這些基因可能在宿主抵抗IBV感染過(guò)程中發(fā)揮重要作用。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示差異表達(dá)基因主要參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞粘附、能量代謝、細(xì)

3、胞因子通路、免疫反應(yīng)、凋亡調(diào)節(jié)等生物進(jìn)程。我們首次對(duì)IBV感染雞的腎臟和脾臟進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，研究結(jié)果為進(jìn)一步深入了解宿主的抗病毒機(jī)制和IBV的致病機(jī)制提供了素材。
　　IFITM是一類重要的抗病毒因子，我們?cè)谶M(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)chIFITM1(LOC422993)在IBV感染的腎臟中顯著上調(diào)表達(dá)。人源和鼠源IFITM蛋白通過(guò)定位在細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)體膜上限制SARS-CoV、流感病毒、登革熱病毒、人類免疫缺陷病毒等多種病毒的侵入

4、，但雞源IFITM1(chIFITM1)在病毒感染中的潛在作用尚未見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)GenBank中標(biāo)注為IFITM3的基因(LOC422993)含有IFITM家族特有的CD225保守結(jié)構(gòu)域，因此LOC422993屬于IFITM家族;但LOC422993缺失YXXΦ氨基酸基序，YXXΦ氨基酸基序的缺失是人源、鼠源、豬源IFITM1蛋白的共性，因此我們認(rèn)為L(zhǎng)OC422993為雞源IFITM1而非IFITM3。通過(guò)熒光定量RT-

5、PCR檢測(cè)chIFITM1基因的體內(nèi)外分布情況時(shí)發(fā)現(xiàn)該基因在各組織分布差別很大，腎臟、氣管和肺臟在轉(zhuǎn)錄水平幾乎檢測(cè)不到chIFITM1的表達(dá)，只有個(gè)別雞檢測(cè)到低拷貝表達(dá);脾臟、胸腺和腺胃的表達(dá)量也較低，而消化道、法氏囊、肝臟和胰腺的表達(dá)量較高。同時(shí)體外培養(yǎng)的DF1和LMH細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)不到chIFITM1的表達(dá);CEF細(xì)胞中有微弱表達(dá)，推測(cè)可能是在制備細(xì)胞過(guò)程中腸道等chIFITM1高表達(dá)組織未能完全去除所致。
　　進(jìn)一步研究

6、發(fā)現(xiàn)在IBV感染致死雞的靶器官氣管和腎臟中chIFITM1 mRNA顯著上調(diào)表達(dá)，其中在腎臟中的上調(diào)倍數(shù)高于氣管中的上調(diào)倍數(shù)，chIFITM1在其它6株IBV分離毒株感染致死雞腎臟組織中同樣上調(diào)表達(dá)，證實(shí)不同IBV毒株的感染普遍誘導(dǎo)chIFITM1上調(diào)表達(dá);鑒于自然狀態(tài)下氣管和腎臟中幾乎檢測(cè)不到chIFITM1的表達(dá)，因此chIFITM1在IBV靶器官氣管和腎臟中屬于病毒誘導(dǎo)型表達(dá)。同為禽呼吸道病毒的NDV感染24h就能在氣管中誘導(dǎo)ch

7、IFITM1上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明chIFITM1較早地參與了機(jī)體抗病毒反應(yīng)。NDV感染致死雞的腎臟、氣管和腺胃中chIFITM1同樣顯著上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明IBV和NDV在體內(nèi)誘導(dǎo)chIFITM1表達(dá)方面具有相似性。體外過(guò)表達(dá)chIFITM1發(fā)現(xiàn)該蛋白顯著抑制NDV的復(fù)制。為了進(jìn)一步鑒定chIFITM1發(fā)揮抗病毒作用的區(qū)域，我們通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)chIFITM1具有N端和C兩個(gè)膜外區(qū)，分別缺失N端35個(gè)氨基酸和C端7個(gè)氨基酸，發(fā)現(xiàn)chIFITM

8、1 C端雖僅有7個(gè)氨基酸，但C端的缺失使得chIFITM1極大地喪失了抑制NDV復(fù)制的能力。我們通過(guò)激光共聚焦實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與人源IFITM1不同，chIFITM1蛋白并沒(méi)有定位于細(xì)胞外膜而是位于細(xì)胞漿中，但并沒(méi)有與內(nèi)體標(biāo)志物L(fēng)AMP1共定位。以往的觀點(diǎn)認(rèn)為IFITM蛋白通過(guò)定位在細(xì)胞膜或內(nèi)體膜上阻止病毒侵入從而發(fā)揮抗病毒作用，鑒于chIFITM1的獨(dú)特定位情況，我們推測(cè)chIFITM1可能與已報(bào)到的人源和鼠源IFITM蛋白不同，具有獨(dú)特的抗