通心絡(luò)促進(jìn)心肌梗死后小鼠缺血心肌血管生成的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　心肌梗死是世界范圍內(nèi)致死致殘的主要原因之一。全世界約三分之一的心衰患者是由它導(dǎo)致的，盡管現(xiàn)在已經(jīng)有了很多治療措施。實(shí)際上，一支主要的冠狀動(dòng)脈的堵塞可以致使心肌的嚴(yán)重缺血和心肌細(xì)胞的快速凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致進(jìn)行性的纖維化代替心肌組織和左心室的擴(kuò)張。進(jìn)展性的左心室重構(gòu)可以導(dǎo)致心肌梗死后心衰，而心衰患者的預(yù)后目前情況依然不容樂(lè)觀。因此，目前以促進(jìn)新生血管來(lái)增加缺血組織灌注的方法，成為治療缺血性心臟疾病的新的希望。
　　通

2、心絡(luò)是一種中國(guó)傳統(tǒng)的中藥復(fù)方制劑，早在1996年被中國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)用于心絞痛和缺血性腦卒中的治療。越來(lái)越多的證據(jù)表明，傳統(tǒng)中藥通心絡(luò)具有心臟保護(hù)作用。通心絡(luò)對(duì)于降低血清脂質(zhì)含量、抑制斑塊炎癥和增強(qiáng)易損斑塊的穩(wěn)定性方面，具有良好的療效。它還可以用來(lái)治療心肌缺血無(wú)復(fù)流和缺血再灌注損傷，并可以改善血管內(nèi)皮功能，然而，我們并不清楚通心絡(luò)在心肌梗死后對(duì)心臟功能和心臟重構(gòu)方面是否有作用。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)了這個(gè)實(shí)驗(yàn)來(lái)研究通心絡(luò)對(duì)心肌梗死

3、后小鼠的心臟功能和心臟重構(gòu)情況的影響，及其作用機(jī)制。
　　研究目的:
　　1.建立小鼠心肌梗死模型，觀察通心絡(luò)對(duì)心肌梗死導(dǎo)致缺血后心臟功能和心室重構(gòu)的影響。
　　2.闡明通心絡(luò)對(duì)心肌梗死保護(hù)效果的可能的作用機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.動(dòng)物分組
　　C57BL/6背景小鼠（10周齡，雄性），隨機(jī)分為5組。(1)假手術(shù)組;(2)心肌梗死模型組，只用生理鹽水溶液灌胃(10mL/kg/day);(3)通心

4、絡(luò)低劑量治療組，通心絡(luò)灌胃量為0.38克/千克體重/天;(4)通心絡(luò)中劑量治療組，通心絡(luò)灌胃量為0.75克/千克體重/天;(5)通心絡(luò)高劑量治療組，通心絡(luò)灌胃量為1.5克/千克體重/天。術(shù)前預(yù)喂藥1周，術(shù)后持續(xù)灌胃30天，分別在術(shù)后第7天處死各組實(shí)驗(yàn)小鼠10只～15只，30天末處死剩余全部小鼠。
　　2.小鼠心肌梗死模型的建立
　　使用異氟烷麻醉小鼠并給予維持，建立呼吸支持，模型組與治療組均行冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎術(shù)。頸部及左

5、前胸脫毛，剪開(kāi)頸部皮膚，行氣管插管。建立有效呼吸支持后，開(kāi)胸，剪開(kāi)心包，暴露冠狀動(dòng)脈左前降支。用7-0的無(wú)損縫合線進(jìn)行冠狀動(dòng)脈結(jié)扎，結(jié)扎成功后，左心室前壁會(huì)變蒼白并且運(yùn)動(dòng)異常，逐層關(guān)胸。假手術(shù)組只開(kāi)胸穿線，不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，手術(shù)時(shí)間與其他組匹配。
　　3.超聲分析
　　術(shù)后30天時(shí)，將異氟烷麻醉的小鼠進(jìn)行經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖檢測(cè)，用來(lái)評(píng)估左心室功能。選取頻率為35MHz的712型超聲探頭進(jìn)行的心臟大小和功能參數(shù)的采集，用高分辨率超聲

6、Vevo770系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。探頭放置于小鼠左前胸，在心臟乳頭肌水平進(jìn)行M型超聲檢測(cè)，測(cè)量舒張末期左心室內(nèi)徑(LVIDd)、收縮末期左室內(nèi)徑(LVIDs)。系統(tǒng)自動(dòng)算出射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率。
　　4.組織學(xué)分析
　　術(shù)后7天、30天，處死相應(yīng)小鼠，使用小鼠左心室石蠟切片進(jìn)行組織學(xué)分析。在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)麻醉后，開(kāi)胸，剪開(kāi)右心耳，進(jìn)行生理鹽水灌注，注射少量10％氯化鉀使之停搏在舒張期，待血液沖洗干凈，進(jìn)行甲醛灌注固定、組織脫水、浸

7、蠟切片。制備51μm石蠟于HE染色、Masson三色染色及免疫組化（熒光）染色。使用HE染色切片計(jì)算左心室梗死百分比;使用Masson染色進(jìn)行測(cè)量梗死周邊區(qū)間質(zhì)纖維化;使用免疫組化檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)的陽(yáng)性率。分析使用IPP圖像處理軟件。
　　5.凋亡檢測(cè)
　　使用原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)梗死周邊區(qū)心肌細(xì)胞的凋亡率，整個(gè)核完全被染色的心肌細(xì)胞被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞。
　　6.毛細(xì)血管密度
　　使用CD31(PECAM-1)作

8、為血管內(nèi)皮標(biāo)志物，檢測(cè)圍梗死區(qū)毛細(xì)血管密度。
　　7.蛋白表達(dá)水平檢測(cè)(Western Blot)
　　術(shù)后7天，提取梗死心臟周邊區(qū)的組織進(jìn)行蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)。提取蛋白、測(cè)定蛋白濃度、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育一抗及二抗最后用化學(xué)發(fā)光顯色。用IPP軟件進(jìn)行表達(dá)量分析。
　　8.凝膠電泳遷移分析(EMSA)
　　使用凝膠電泳遷移分析(EMSA)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)因子1α活性。提取圍梗死區(qū)心臟組織核蛋白，電泳

9、，交聯(lián)，封閉，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。
　　9.數(shù)據(jù)分析
　　數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。用SPSS18.0軟件做統(tǒng)計(jì)分析。組間比較使用單因素方差分析(one-wayANOVA)分析方法，檢驗(yàn)方差齊性，若數(shù)據(jù)方差齊，使用LSD檢驗(yàn);若數(shù)據(jù)方差不齊，使用Dunnett's T3檢驗(yàn)。P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果:
　　1.一般情況及生存率分析
　　假手術(shù)組小鼠術(shù)后無(wú)死亡，一般情況良好。通心絡(luò)干預(yù)減少了實(shí)驗(yàn)

10、性心肌梗死小鼠的死亡率。
　　2.心臟超聲檢測(cè)
　　術(shù)后30天檢測(cè)左心室功能參數(shù)，通心絡(luò)治療改善了心肌梗死后心臟功能參數(shù)。
　　3.梗死大小
　　H&E染色顯示，應(yīng)用通心絡(luò)治療后，梗死百分比顯著減小。
　　4.心肌間質(zhì)纖維化
　　使用Masson染色檢測(cè)梗死周邊區(qū)的纖維化程度。應(yīng)用通心絡(luò)后，可以顯著減少心梗引起的纖維化情況。
　　5.TUNEL染色
　　經(jīng)過(guò)通心絡(luò)干預(yù)后，心肌梗死引發(fā)的凋亡

11、情況顯著改善。
　　6.毛細(xì)血管密度
　　與模型組相比較，通心絡(luò)各組表現(xiàn)出更高的毛細(xì)血管密度。
　　7.Western blot
　　通心絡(luò)治療可以增加PI3K、磷酸化AKT、磷酸化ERK、磷酸化eNOS和血管生長(zhǎng)因子的表達(dá)。
　　8.EMSA
　　通心絡(luò)治療增加了缺氧誘導(dǎo)因子1α的DNA結(jié)合活性。
　　結(jié)論:
　　1.通心絡(luò)具有改善心肌梗死小鼠后心臟功能和減弱心室重構(gòu)的作用。