內(nèi)源性硫化氫參與耐熱肝癌細(xì)胞HepG-2-tt多藥耐藥性的形成.pdf

1、【目的】
　　探討內(nèi)源性硫化氫是否參與了耐熱肝癌細(xì)胞株多藥耐藥性的形成及其可能的機(jī)制。
　　【方法】
　　將普通肝癌細(xì)胞 HepG-2在43℃水浴環(huán)境下培養(yǎng)4小時(shí)后建立耐熱肝癌細(xì)胞株做為研究模型。設(shè) HepG-2細(xì)胞和HepG-2/tt細(xì)胞兩組，用 CCK-8法檢測(cè)HepG-2和HepG-2/tt細(xì)胞對(duì)ADM、5-FU和CTX的IC50值；RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中CBS、CSE和MPST的mRNA表達(dá)水平；利用硫化氫合酶

2、抑制劑抑制 CBS活性；利用RNA干擾技術(shù)沉默HepG-2細(xì)胞CBS的表達(dá)；Western Blot檢測(cè)HepG-2和HepG-2/tt細(xì)胞中P-gp、Bcl-2和BDNF蛋白的表達(dá)情況。
　　【結(jié)果】
　　1.耐熱肝癌細(xì)胞HepG-2/tt具有多藥耐藥性。
　　建立耐熱肝癌細(xì)胞株HepG-2/tt模型后，通過(guò)CCK-8法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ADM、5-FU和CTX作用于HepG-2/tt細(xì)胞72h后的IC50值分別為1.08±

3、0.11mg/L、541.56±73.41mg/L和9086.24±698.23mg/L均明顯高于對(duì)照組HepG-2細(xì)胞的0.32±0.06mg/L、19.74±2.47mg/L和1970.76±104.53 mg/L(P<0.01)，明確耐熱肝癌細(xì)胞株HepG-2/tt模型具有多藥耐藥性。
　　2.耐熱肝癌細(xì)胞HepG-2/tt中P-gp、Bcl-2和BDNF蛋白表達(dá)上調(diào)。
　　Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HepG-

4、2/tt細(xì)胞對(duì)比HepG-2細(xì)胞其P-gp、Bcl-2和BDNF蛋白的表達(dá)量均明顯增加(P<0.01)，說(shuō)明HepG-2/tt細(xì)胞具有多藥耐藥性細(xì)胞特征，且提示耐熱肝癌細(xì)胞多藥耐藥性的形成可能與上調(diào)P-gp、Bcl-2蛋白和BDNF-TrkB通路的介導(dǎo)作用有關(guān)。
　　3.耐熱肝癌細(xì)胞中內(nèi)源性硫化氫合酶mRNA表達(dá)增加。
　　RT-PCR結(jié)果表明， HepG-2/tt細(xì)胞對(duì)比HepG-2細(xì)胞其內(nèi)源性硫化氫合成酶CBS、CSE和

5、MPST的mRNA表達(dá)量明顯增加(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05)，表明耐熱肝癌細(xì)胞比肝癌細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源性硫化氫合酶表達(dá)增加。
　　4.抑制內(nèi)源性硫化氫的生成可以降低耐熱肝癌細(xì)胞的多藥耐藥性。
　　4.1、 AOAA抑制CBS酶活性、減少H2S的生成可以降低耐熱肝癌細(xì)胞的耐藥性。
　　用內(nèi)源性硫化氫合酶CBS抑制劑—AOAA抑制CBS活性后，5-FU分別作用72h后通過(guò)CCK-8法計(jì)算發(fā)現(xiàn)，處理后的耐熱肝癌細(xì)胞的

6、IC50值222.89±38.95mg/L，對(duì)比未加入抑制劑的耐熱肝癌細(xì)胞的IC50值541.55±73.41mg/L明顯降低（P＜0.01）。提示抑制內(nèi)源性H2S合酶活性，減少H2S的生成能夠降低耐熱肝癌細(xì)胞的耐藥性。
　　4.2、 CBS-siRNA抑制細(xì)胞CBS基因翻譯、減少內(nèi)源性H2S的生成能降低耐熱肝癌細(xì)胞的耐藥性。
　　利用RNA干擾技術(shù)沉默CBS基因的翻譯后，測(cè)得CBS-siRNA組的耐熱肝癌細(xì)胞ADM作用72

7、h后的IC50值0.77±0.10mg/l，低于耐熱肝癌細(xì)胞組的IC50值1.08±0.11mg/l，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。而Scram組耐熱肝癌細(xì)胞ADM的IC50值1.10±0.11mg/l，與耐熱肝癌細(xì)胞相比無(wú)明顯差異（P>0.05）。結(jié)果同樣說(shuō)明抑制內(nèi)源性硫化H2S的生成可以降低耐熱肝癌細(xì)胞的耐藥性。
　　【結(jié)論】?jī)?nèi)源性H2S參與了耐熱肝癌細(xì)胞HepG-2/tt多藥耐藥性的形成，其機(jī)制可能與上調(diào)P-gP、Bcl