FOXL2對雞卵泡顆粒細(xì)胞分化的作用及機(jī)制研究.pdf

1、卵巢發(fā)育是一個(gè)受多因子調(diào)控的動(dòng)態(tài)過程，其發(fā)育狀態(tài)直接影響母雞的產(chǎn)蛋能力，但具體的調(diào)控機(jī)制以及卵泡選擇機(jī)理仍不清楚。顆粒細(xì)胞是最早發(fā)育的卵泡體細(xì)胞，其分化與卵泡選擇過程密切相關(guān)。FOXL2（Forkhead box L2）是哺乳動(dòng)物卵巢發(fā)育的重要調(diào)控因子。本研究將圍繞FOXL2在雞卵泡顆粒細(xì)胞分化過程中的作用進(jìn)行系統(tǒng)研究。首先使用定量PCR、整體原位雜交和免疫熒光等技術(shù)對FOXL2在雞胚胎性腺及性成熟卵巢中的表達(dá)模式進(jìn)行研究，為探索FOX

2、L2在雞卵巢發(fā)育過程中的作用提供基礎(chǔ);其次離體培養(yǎng)雞等級前(SGCs)和等級卵泡顆粒細(xì)胞(BGCs)，并將重組的FOXL2真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入離體培養(yǎng)的雞卵泡顆粒細(xì)胞中，使用高通量測序技術(shù)檢測FOXL2過表達(dá)后細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄本的變化情況，并利用生物信息學(xué)技術(shù)分析FOXL2對雞卵泡顆粒細(xì)胞的調(diào)控作用;最后使用雙熒光素酶報(bào)告基因的方法檢測FOXL2對芳香化酶基因(Cytochrome P450 aromatase，P450arom/CYP19)啟

3、動(dòng)子活性的調(diào)控作用。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)在雞胚胎期泌尿生殖系統(tǒng)中，F(xiàn)OXL2主要在雌性性腺中表達(dá)，在雄性性腺中始終無明顯表達(dá)。在雌性性腺中，F(xiàn)OXL2在E4.5開始表達(dá)，隨著胚齡增加逐漸上調(diào)。在性成熟母雞卵泡中，F(xiàn)OXL2主要在卵泡顆粒細(xì)胞中表達(dá)，而膜細(xì)胞中無明顯表達(dá)。FOXL2在小白卵泡和大白卵泡中即有表達(dá)，在小黃卵泡顆粒細(xì)胞中開始上調(diào)并在等級卵泡顆粒細(xì)胞中表達(dá)量維持在一個(gè)較高的水平，到F1卵泡顆粒細(xì)胞中表達(dá)量達(dá)到高峰

4、。
　　(2)在離體培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染空載體（對照組）和FOXL2真核表達(dá)載體后（過表達(dá)組），使用定量PCR檢測FOXL2的表達(dá)量，結(jié)果顯示與對照組相比，過表達(dá)組中FOXL2的表達(dá)量極顯著上調(diào)（SGCs中超過20倍，BGCs中超過6倍）。
　　(3)選擇同一批次處理的SGCs和BGCs（對照組及過表達(dá)組）各2個(gè)進(jìn)行數(shù)字化表達(dá)譜測序，共得到97，148，313條Clean reads，通過與參考基因序列比對注釋全部8個(gè)樣

5、本共獲得14，280個(gè)基因。將樣本按照如下的組進(jìn)行兩兩對比:CTRL-BGCsvs.CTRL-SGCs（命名為Comp.1），F(xiàn)OXL2-SGCs vs.CTRL-SGCs（命名為Comp.2），F(xiàn)OXL2-BGCs vs.CTRL-BGCs（命名為Comp.3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Comp.1中有1，575個(gè)差異基因（Differentially expressed genes，DEGs）（885個(gè)上調(diào)基因，690個(gè)下調(diào)基因）;在Comp.2

6、中有207個(gè)DEGs（112個(gè)基因被FOXL2激活，95個(gè)基因被抑制）;在Comp.3中有201被FOXL2調(diào)控的基因（84個(gè)被激活基因，117個(gè)被抑制基因）。
　　(4)GO注釋分析發(fā)現(xiàn)在Comp.1中超過90％差異表達(dá)基因與細(xì)胞學(xué)過程相關(guān);在Comp.2中DEGs主要與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程;在Comp.3中DEGs主要影響細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性以及細(xì)胞外基質(zhì)形成等過程。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)Comp.1中的DEGs主要富集在“focal ad

7、hesion”，“cell cycle”，以及“ECM-receptor interaction”通路中;Comp.2中的DEGs主要影響“cytokine-cytokine receptor interaction”通路;Comp.3中的DEGs主要影響“focal adhesion”和“ECM-receptor interaction”通路。
　　(5)使用Comp.1和Comp.2的并集基因結(jié)果篩選FOXL2在顆粒細(xì)胞分化過

8、程中作用的候選通路和候選基因。結(jié)果顯示FOXL2可能是通過“focal adhesion”和“cytokine-cytokine receptor interaction”兩條通路調(diào)控雞卵泡顆粒細(xì)胞的分化過程。
　　(6)綜合分析3組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)Comp.2和Comp.3的共同基因表達(dá)變化趨勢幾乎均相反。STEM表達(dá)模式結(jié)果顯示當(dāng)FOXL2在等級前顆粒細(xì)胞中過表達(dá)后，基因表達(dá)模式的變化方向與顆粒細(xì)胞分化過程中的模式相同;而當(dāng)FOXL2