hTERT基因轉(zhuǎn)染對(duì)人胚胎皮質(zhì)神經(jīng)元生長(zhǎng)和凋亡的影響.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer’sDisease，AD)是一種常見(jiàn)于老年人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，常伴有廣泛的海馬和新皮質(zhì)神經(jīng)元和突觸的丟失?，F(xiàn)在大多數(shù)學(xué)說(shuō)都認(rèn)為神經(jīng)元的丟失是由神經(jīng)元的凋亡所引起。另外，神經(jīng)元的異常衰老也和AD的發(fā)病有著一定的聯(lián)系。 細(xì)胞的衰老與死亡與染色體末端的端粒(telomere)有關(guān)。端粒是染色體穩(wěn)定、細(xì)胞生存所必需。端粒的結(jié)構(gòu)、長(zhǎng)短及其位置決定著細(xì)胞的生存狀態(tài)，被譽(yù)為“有絲分裂的生物鐘”。端粒酶(

2、telomerase)是細(xì)胞核內(nèi)一種核糖核蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶，端粒酶復(fù)合物能以自身RNA為模板，在其催化亞基TERT的催化下合成端粒的DNA重復(fù)序列，以延長(zhǎng)端粒長(zhǎng)度，從而延長(zhǎng)細(xì)胞的生命，被稱(chēng)為細(xì)胞的“永生化”。 在神經(jīng)系統(tǒng)，由于終末分化的成熟神經(jīng)元退出了細(xì)胞分裂周期，并不需要通過(guò)端粒酶延長(zhǎng)端粒的長(zhǎng)度來(lái)維持細(xì)胞的生命，所以對(duì)神經(jīng)元內(nèi)端粒酶表達(dá)的研究很少。而且，一般對(duì)神經(jīng)元內(nèi)端粒酶活性有關(guān)的研究都是采用嚙齒動(dòng)物模型，但嚙齒動(dòng)物其神經(jīng)元成熟

3、后，在出生后一段時(shí)期內(nèi)仍具有端粒酶活性，與成熟后在胚胎早期即無(wú)端粒酶活性的人類(lèi)神經(jīng)元大有不同。本研究通過(guò)構(gòu)建帶有hTERT基因的腺病毒載體，將hTERT基因?qū)肴祟?lèi)胚胎神經(jīng)元，觀察其對(duì)神經(jīng)元生存和凋亡的影響，從而為預(yù)防和治療AD的藥物的開(kāi)發(fā)提供方便。 目的：制備攜帶hTERT基因的pSU-CMV-hTERT腺病毒，將其轉(zhuǎn)染人胚胎神經(jīng)元，觀察hTERT在神經(jīng)元內(nèi)的表達(dá)情況。并觀察基因轉(zhuǎn)染后對(duì)神經(jīng)元生長(zhǎng)活力和凋亡的影響。 方

4、法：以pCI-neo-hTERT質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)引物，PCR法獲取目的基因；將目的基因定向克隆到pSU-CMV穿梭質(zhì)粒得到重組穿梭質(zhì)粒pSU-CMV-hTERT，酶切鑒定；將pSU-CMV-TERT質(zhì)粒與含有5型腺病毒右臂的質(zhì)粒pBHGE3通過(guò)Lipofectamine2000共轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞進(jìn)行重組，并在293細(xì)胞內(nèi)包裝、擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)病毒純化后，得到經(jīng)酶切鑒定正確的pSU-CMV-hTERT非增殖型腺病毒。取3月齡左右引產(chǎn)人胚胎，體外

5、培養(yǎng)皮質(zhì)及海馬神經(jīng)元。將病毒以最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)感染人胚胎神經(jīng)元，設(shè)立對(duì)照病毒組觀察感染情況。免疫細(xì)胞化學(xué)熒光染色的方法觀察神經(jīng)元內(nèi)hTERT的表達(dá)情況。分別取接種病毒后24h、72h、1周、2周、3周的神經(jīng)元進(jìn)行MTT法測(cè)量其細(xì)胞活力。設(shè)對(duì)照病毒組，并算出每個(gè)時(shí)間點(diǎn)hTERT轉(zhuǎn)染后對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)率。用TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)元凋亡情況。熒光顯微鏡下分析其結(jié)果。 結(jié)果：重組穿梭質(zhì)粒pSU-CMV-hTERT經(jīng)酶切鑒定正確，并與骨

6、架質(zhì)粒正確重組，經(jīng)包裝擴(kuò)增后得到非增殖型腺病毒，命名為pSU-CMV-hTERT腺病毒。3月齡人胚胎皮質(zhì)及海馬神經(jīng)元生長(zhǎng)較好，在病毒轉(zhuǎn)染后24h時(shí)神經(jīng)元內(nèi)已有病毒表達(dá)，在24h、72h、1周、2周末時(shí)，免疫細(xì)胞化學(xué)熒光染色方法可以看到神經(jīng)元內(nèi)有hTERT的表達(dá)，到第3周末時(shí)表達(dá)減弱。hTERT基因轉(zhuǎn)染后的神經(jīng)元其平均細(xì)胞活力較對(duì)照病毒組高，但在第3周末時(shí)兩組細(xì)胞活力差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。轉(zhuǎn)染病毒后24h、72h、1周、2周、3周，hTER

7、T基因轉(zhuǎn)染對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)率分別為27.4％、42.4％、17.3％、7.4％和15.9％。TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，熒光顯微鏡下觀察到實(shí)驗(yàn)組病毒轉(zhuǎn)染后24h、72h、1周、2周，神經(jīng)元凋亡較對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)明顯減少，在轉(zhuǎn)染后3周時(shí)差異不明顯。高倍(200×)鏡下各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組熒光率分別減少52％、59％、32％、28％、6.5％(圖15)。 結(jié)論：1、構(gòu)建pSU-CMV-hTERT腺病毒，對(duì)人胚胎皮質(zhì)神經(jīng)元進(jìn)行感染。結(jié)果

8、發(fā)現(xiàn)，該病毒對(duì)神經(jīng)元有很好的感染力，目的基因表達(dá)較好。2、hTERT基因轉(zhuǎn)染人胚胎皮質(zhì)神經(jīng)元后，較感染未帶有hTERT基因的對(duì)照病毒組而言，實(shí)驗(yàn)病毒組的細(xì)胞活力增強(qiáng)。說(shuō)明hTERT基因轉(zhuǎn)染對(duì)人胚胎皮質(zhì)神經(jīng)元有一定的保護(hù)作用。在第3天時(shí)，病毒轉(zhuǎn)染對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用最強(qiáng)。在第3周末時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞活力無(wú)明顯差異。 3、hTERT基因轉(zhuǎn)染人胚胎皮質(zhì)神經(jīng)元后，神經(jīng)元對(duì)凋亡的抵抗性增強(qiáng)，較感染未帶有hTERT基因的空對(duì)照病毒組而言，