氧化應(yīng)激及Bcl-2在鎘誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞凋亡機(jī)制中的研究.pdf

1、鎘可以誘導(dǎo)機(jī)體多種組織細(xì)胞發(fā)生凋亡。研究鎘誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡對(duì)于鎘的分子毒理學(xué)機(jī)制的闡明和鎘所致的損傷與致癌機(jī)理的研究具有重要意義。本文對(duì)鎘誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生機(jī)制作了如下研究工作： 1 鎘誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞凋亡與氧化應(yīng)激作用在37℃、5％CO2條件下，HEK 293細(xì)胞分別在不同濃度氯化鎘或經(jīng)過(guò)不同處理時(shí)間孵育后，用流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞凋亡率，用分光光度法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase LDH)活

2、性變化，胞漿內(nèi)的活性氧(ROS)水平用流式細(xì)胞儀和激光共聚焦檢測(cè)。結(jié)果顯示：在一定濃度范圍內(nèi)隨著鎘濃度的升高，凋亡率升高，60μ mol/L氯化鎘誘導(dǎo)細(xì)胞6 h，凋亡率達(dá)到最高；細(xì)胞內(nèi)ROS生成量明顯增多。鎘處理后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液LDH活性都有不同程度的升高，并呈現(xiàn)劑量. 時(shí)間效應(yīng)正相關(guān)。提示：鎘誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞凋亡的機(jī)制與ROS上升有關(guān)。 2 活性氧在鎘致HEK293細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)理用分光光度法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA

3、)、還原型谷胱甘肽(GSH)含量、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)活性，以及Western印跡檢測(cè)：BcI-2蛋白、Caspase-3酶原的表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示：MDA含量、GSH含量和GSH-PX活性與鎘的作用呈現(xiàn)劑量. 時(shí)間效應(yīng)；當(dāng)60μ mol/L氯化鎘誘導(dǎo)細(xì)胞6 h，細(xì)胞內(nèi)ROS生成量明顯增多時(shí)，MDA含量明顯增多P<0.01)；GSH含量明顯下降(P<0.01)；GSH-PX活性降低P<0.01)。Bcl-2表達(dá)量較鎘處理

4、3 h時(shí)表達(dá)量有所下降；Caspase-3酶原蛋白表達(dá)下降。提示：通過(guò)ROS引起的氧化損傷、Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)和Caspase-3激活參與了鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。3 Bcl-2對(duì)鎘誘發(fā)HEK293細(xì)胞凋亡的抗凋亡機(jī)理研究建立以pcDNA3/Bcl-2和pcDNA3/Bcl. 2AC轉(zhuǎn)染的HEK 293細(xì)胞作為研究對(duì)象，用MTT染色檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，丫啶橙/溴乙啶雙熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。用60μmol/L CdCl<,2>處理上述細(xì)胞6

5、h后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生情況。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染pcDNA3空白質(zhì)粒的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染了pcDNA3/Bcl-2的HEK293細(xì)胞的細(xì)胞活性顯著升高(P<0.05,P<0.01．)，細(xì)胞的凋亡率也降低，細(xì)胞內(nèi)活性氧也降低；但是轉(zhuǎn)染了pcDNA3/Bcl-2△C的HEK293細(xì)胞的細(xì)胞活性、凋亡率、胞內(nèi)活性氧的含量與對(duì)照組變化不明顯。提示：Bcl-2能夠抑制鎘誘導(dǎo)的：HEK293細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平是其發(fā)揮凋亡作用的重要