RCS大鼠視網(wǎng)膜變性過程中mRGCs與RGCs形態(tài)和功能的對(duì)比研究.pdf

1、視網(wǎng)膜色素變性(retinitispigmentosa，RP)是一種嚴(yán)重的致盲性疾病,究其根本原因在于視網(wǎng)膜變性的病理機(jī)制極為復(fù)雜，在感光細(xì)胞喪失之后內(nèi)層神經(jīng)元也發(fā)生繼發(fā)變性，因此視功能的維持和重建存在巨大的障礙。 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinalganglioncells，RGCs)以動(dòng)作電位的方式將視覺信息編碼、整合，然后投射至高級(jí)視覺中樞，因此節(jié)細(xì)胞的功能狀態(tài)決定著視覺信息的最終輸出。感光神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(intrinsical

2、lyphotosensitiveRGCs，ipRGCs)是RGCs中含有特殊感光色素melanopsin的一小類細(xì)胞(因此也叫melanopsin-containingRGCs，mRGCs)，它不需要接受來自視錐視桿的信息輸入而直接感光。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在慢性高眼壓狀態(tài)下ipRGCs較普通RGCs更能抵抗壓力的影響而存留，在視網(wǎng)膜變性過程中mRGCs如何變化未見報(bào)道。mRGCs與RGCs相比不需要接受來自視錐視桿的信息輸入，而所在的視網(wǎng)膜層次

3、、視網(wǎng)膜微環(huán)境完全相同，因此對(duì)mRGCs在視網(wǎng)膜色素變性過程中形態(tài)和功能深入研究，對(duì)比RGCs的形態(tài)和功能特性，將對(duì)揭示RGCs繼發(fā)變性提供極為重要的線索，也為視網(wǎng)膜變性之后神經(jīng)元的保護(hù)和功能重建提供新的思路。 本實(shí)驗(yàn)室采用視網(wǎng)膜色素變性的經(jīng)典動(dòng)物模型RCS大鼠，在前期的研究中發(fā)現(xiàn)變性晚期RGCs數(shù)量顯著減少，進(jìn)一步功能研究發(fā)現(xiàn)變性RGCs被動(dòng)膜學(xué)特性和動(dòng)作電位的發(fā)放類型、發(fā)放頻率等也發(fā)生改變，部分RGCs甚至失去動(dòng)作電位的發(fā)放

4、。提示在感光細(xì)胞變性死亡之后，RGCs在數(shù)量和功能上也發(fā)生了明顯的變性。然而RGCs繼發(fā)變性死亡的觸發(fā)機(jī)制至今尚不清楚。 視網(wǎng)膜神經(jīng)元胞膜上各種離子通道的表達(dá)、電流密度和動(dòng)力學(xué)特性，動(dòng)作電位的類型、發(fā)放頻率和幅度，以及神經(jīng)遞質(zhì)和受體的分布及功能狀況共同決定了視網(wǎng)膜神經(jīng)元的存活或死亡，以及視覺信息的傳遞。因此研究RCS大鼠視網(wǎng)膜變性過程中RGCs通道特性將對(duì)理解其膜學(xué)特性改變的分子蛋白基礎(chǔ)提供依據(jù)。 本研究的目的是通過對(duì)R

5、CS大鼠視網(wǎng)膜變性過程中mRGCs和RGCs形態(tài)、膜特性、通道電流和鈣流變化的研究，結(jié)合本課題組和既往其他學(xué)者的研究結(jié)果，對(duì)視網(wǎng)膜變性的病理機(jī)制有更深入的了解，為未來視網(wǎng)膜變性中神經(jīng)元的保護(hù)、功能的重建提供線索；建立大鼠逆行標(biāo)記RGCs和mRGCs并在熒光顯微鏡下對(duì)視網(wǎng)膜組織切片上不同類型細(xì)胞分類進(jìn)行膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)，為未來視網(wǎng)膜細(xì)胞和組織、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等進(jìn)行深入探討，從而為揭示視覺功能的本質(zhì)和變性的病理機(jī)制建立平臺(tái)。 本研究采

6、用視網(wǎng)膜鋪片和切片免疫熒光染色、視交叉上核(SCN)Fluorogold逆行標(biāo)記，研究了視網(wǎng)膜變性過程中mRGCs在視網(wǎng)膜中的分布情況、形態(tài)學(xué)特征和數(shù)量變化；采用westernblot檢測(cè)melanopsin蛋白在視網(wǎng)膜變性過程中的表達(dá)情況；采用視網(wǎng)膜切片膜片鉗，研究變性過程中RGCs鈉鉀離子電流幅值、密度、Ⅰ-Ⅴ曲線等動(dòng)力學(xué)特性；采用免疫組織化學(xué)染色和westernblot研究電壓依賴性鈉通道蛋白在變性過程中的表達(dá)變化；運(yùn)用鈣成像技術(shù)

7、探討RGCs在變性過程中胞內(nèi)鈣的強(qiáng)度變化；在立體定位下行SCN逆行標(biāo)記感光神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，在熒光顯微鏡下對(duì)mRGCs行膜片鉗全細(xì)胞記錄，研究mRGCs的電生理學(xué)特性，并與對(duì)照大鼠進(jìn)行比較。 本課題在以下方面進(jìn)行較為深入的研究后得到如下結(jié)果和結(jié)論： 第一部分：RCS大鼠視網(wǎng)膜變性過程中mRGCs的分布、形態(tài)、數(shù)量和melanopsin蛋白的表達(dá) 感光神經(jīng)節(jié)細(xì)胞mRGCs是近年來發(fā)現(xiàn)的視網(wǎng)膜內(nèi)一種特殊的神經(jīng)元，它含有一種

8、特殊的感光色素melanopsin，不需要視錐視桿的輸入而直接感光。那么在視網(wǎng)膜變性過程中，mRGCs的分布、形態(tài)學(xué)特征和數(shù)量發(fā)生了怎樣的改變?melanopsin蛋白的表達(dá)如何變化?與RGCs變化的關(guān)系如何?本研究采用視網(wǎng)膜鋪片和切片免疫熒光染色、視交叉上核(SCN)Fluorogold逆行標(biāo)記方法，研究視網(wǎng)膜變性過程中mRGCs在視網(wǎng)膜中的分布情況、形態(tài)學(xué)特征和數(shù)量變化；采用westernblot檢測(cè)melanopsin蛋白在視網(wǎng)膜

9、變性過程中的表達(dá)情況。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 1、成功完成在上丘和外膝體逆行Fluorogold對(duì)RGCs的標(biāo)記，以及視交叉上核SCN對(duì)mRGCs的逆行標(biāo)記；逆行標(biāo)記的mRGCs和RGCs在視網(wǎng)膜變性過程中數(shù)量、分布和比例的改變與免疫熒光染色結(jié)果一致，表明兩種方法確實(shí)可信。 2、視網(wǎng)膜鋪片和切片免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)mRGCs散在分布于RCS大鼠和對(duì)照大鼠視網(wǎng)膜各區(qū)域，顳側(cè)相對(duì)分布較多，但在上、下、鼻、顳四個(gè)象限的分布無顯著

10、差異；melanopsin不僅表達(dá)于mRGCs的胞膜和胞漿，也表達(dá)于樹突和軸突，且變性晚期突起上melanopsin染色增強(qiáng)；mRGCs形態(tài)上類似于α神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，其樹突伸向內(nèi)叢狀層(IPL)和內(nèi)核層(INL)，但未見與其它神經(jīng)元構(gòu)成緊密聯(lián)系。 3、在RCS大鼠變性過程中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層的數(shù)量顯著減少，而mRGCs的數(shù)量無明顯減少，mRGCs與RGCs的比例在變性晚期反而增高。 4、Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)mela

11、nopsin分子量在60kd左右，變性晚期melanopsin蛋白的表達(dá)顯著升高。提示在RCS大鼠視網(wǎng)膜變性過程中與RGCs相比mRGCs似乎存在一種能耐受變性的影響而得以保留的特質(zhì)，進(jìn)一步的研究尋找其耐受變性的原因，可為未來視網(wǎng)膜變性疾病中神經(jīng)元的保護(hù)、視功能的重建提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。 第二部分：RCS大鼠視網(wǎng)膜變性過程中RGCs鈉鉀通道特性和胞內(nèi)鈣變化 RCS大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞在感光細(xì)胞變性死亡之后數(shù)量顯著減少，前期研

12、究發(fā)現(xiàn)變性晚期相當(dāng)部分的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞失去動(dòng)作電位的發(fā)放功能。為了回答導(dǎo)致神經(jīng)節(jié)細(xì)胞失去發(fā)放功能的分子蛋白基礎(chǔ)是什么，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞膜上的離子通道蛋白發(fā)生了什么樣的改變，通道電流特性如何，本課題采用視網(wǎng)膜切片膜片鉗全細(xì)胞記錄研究變性過程中RGCs鈉鉀離子電流幅值、密度、Ⅰ-Ⅴ曲線等動(dòng)力學(xué)特性；采用免疫組織化學(xué)染色和westernblot研究電壓依賴性鈉通道蛋白在變性過程的表達(dá)變化；運(yùn)用鈣成像技術(shù)探討RGCs在變性過程中胞內(nèi)鈣的濃度變化。

13、 結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 1、在視網(wǎng)膜切片上成功完成RGCs的全細(xì)胞記錄，結(jié)合阻斷劑成功記錄到內(nèi)向的鈉電流和外向的鉀電流，發(fā)現(xiàn)RCS大鼠變性晚期鈉離子電流顯著受損，需要在較高的鉗制電壓下才能誘發(fā)出微弱的電流，相對(duì)鉀電流受損較輕。鈉通道蛋白免疫熒光染色和Westernblot檢測(cè)顯示變性晚期鈉通道蛋白明顯受損或減少。 2、在變性晚期RGCs被動(dòng)膜學(xué)特性(RMP、IR、Cm等)發(fā)生改變，在P60d時(shí)約27.3％(6/22)，P90d時(shí)

14、66.7％(12118)的RGCs不能誘發(fā)出動(dòng)作電位。 3、RGCs鈣成像顯示變性晚期RGCs胞內(nèi)呈鈣超載。以上結(jié)果提示：RCS大鼠變性晚期RGCs鈉離子電流顯著降低，通道蛋白表達(dá)下降，是RGCs失去動(dòng)作電位發(fā)放的最直接原因；鉀電流改變輕微，保證了RCS大鼠變性后期RGCs的基本生理狀態(tài)的維持和存活；胞內(nèi)鈣超載激活一系列胞內(nèi)效應(yīng)酶，最終引起神經(jīng)元損傷或死亡，是RGCs死亡或失能的始動(dòng)機(jī)制。然而引起視網(wǎng)膜變性過程中RGCs胞內(nèi)鈣濃

15、度增加、激活一系列生化反應(yīng)鏈以及信息傳導(dǎo)通路，引發(fā)膜通道蛋白、膜受體等的改變，最終導(dǎo)致神經(jīng)元失能甚至死亡的病理機(jī)制，尚待進(jìn)一步深入研究。而感光神經(jīng)節(jié)細(xì)胞mRGCs的數(shù)量在變性晚期不僅沒有減少，與RGCs的比例反而增高，那么mRGCs在視網(wǎng)膜變性過程中電生理功能如何，是下一步的研究?jī)?nèi)容。 第三部分：RCS大鼠視網(wǎng)膜變性過程中mRGCs電生理學(xué)特性 在立體定位下成功完成FluorogoldSCN逆行標(biāo)記mRGCs，并在熒光顯

16、微鏡下完成全細(xì)胞記錄，研究mRGCs的電生理學(xué)特性，并與對(duì)照大鼠進(jìn)行比較。 結(jié)果顯示： 1、建立和完善了SCN逆行標(biāo)記mRGCs并在熒光顯微鏡下行mRGCs膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)。 2、發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜變性過程中mRGCs的膜學(xué)特性(包括RMP、IR、Cm等)無顯著改變。 3、RCS大鼠mRGCs動(dòng)作電位以瞬變型為主，其發(fā)放頻率、幅度與對(duì)照大鼠相比無顯著差異。 4、成功記錄到mRGCs鈉鉀離子電流，RCS

17、大鼠視網(wǎng)膜變性過程中mRGCs動(dòng)力學(xué)特性與對(duì)照大鼠相似，未發(fā)現(xiàn)明顯改變。 5、成功行mRGCs細(xì)胞內(nèi)染色，其形態(tài)學(xué)特性與正常大鼠相比無顯著差異。在一例mRGCs細(xì)胞內(nèi)染色中發(fā)現(xiàn)與RGCs存在染色耦合，兩者之間是否存在信息交流有待進(jìn)一步研究。 以上結(jié)果提示：成功建立大鼠逆行標(biāo)記RGCs和mRGCs并在熒光顯微鏡下對(duì)視網(wǎng)膜組織切片上不同細(xì)胞類型分類進(jìn)行膜片鉗全細(xì)胞記錄，為未來視網(wǎng)膜細(xì)胞和組織、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等進(jìn)行深入探討，從而為揭

18、示視覺功能的本質(zhì)和變性的病理機(jī)制建立平臺(tái)；對(duì)mRGCs的膜學(xué)特性和膜通道特性進(jìn)行了深入研究，尤其對(duì)視網(wǎng)膜變性過程中mRGCs的功能特性進(jìn)行了較為詳盡的探討，為視網(wǎng)膜變性機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)；對(duì)于視網(wǎng)膜變性過程中RGCs的變性死亡和mRGCs的形態(tài)和功能存留做了初步探索，為神經(jīng)元的保護(hù)、視網(wǎng)膜變性功能重建提供線索；mRGCs與RGCs之間存在染色耦合現(xiàn)象，但兩者之間究竟是否存在信息的交流，對(duì)視覺信息或非圖像視覺系統(tǒng)具有什么樣的意義，有待進(jìn)一步