牛糞堆肥中厭氧氨氧化菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性研究.pdf

1、堆肥技術(shù)作為處理廢棄物有效方法，解決了畜禽糞便直接排放到環(huán)境中，對(duì)環(huán)境造成污染及占用空間等問(wèn)題，同時(shí)達(dá)到資源合理利用的目的。氮的含量作為堆肥的重要指標(biāo)，影響著堆肥質(zhì)量，所以氮素轉(zhuǎn)化是堆肥中非常重要的部分。厭氧氨氧化作用是在厭氧條件下使NH4+-N和NO2--N轉(zhuǎn)變?yōu)镹2的過(guò)程，屬于氮素轉(zhuǎn)化的一部分。厭氧氨氧化菌普遍存在多種環(huán)境中，理論上堆肥系統(tǒng)中也應(yīng)該存在厭氧氨氧化菌，但是關(guān)于堆肥中厭氧氨氧化菌的報(bào)道卻很少。本研究使用自制發(fā)酵罐進(jìn)行堆肥

2、，以模擬快速堆肥過(guò)程，來(lái)研究參與牛糞和稻稈混合堆肥中的厭氧氨氧化菌。通過(guò)堆肥樣品理化指標(biāo)的測(cè)定，應(yīng)用克隆文庫(kù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-梯度變性凝膠電泳(PCR-DGGE)、定量PCR的方法檢測(cè)堆肥中的厭氧氨氧化菌，探討厭氧氨氧化菌在牛糞堆肥過(guò)程中的群落結(jié)構(gòu)、多樣性及豐度的變化情況。本課題的研究將會(huì)進(jìn)一步豐富堆肥氮素循環(huán)理論，同時(shí)為厭氧氨氧化菌的廣泛分布提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)堆肥過(guò)程共進(jìn)行30 d，在第3d進(jìn)入高溫期(

3、＞45℃)，堆體于堆肥發(fā)酵的第5d達(dá)到最高溫58℃，堆體高溫期持續(xù)8 d(3 d～10 d)。在整個(gè)堆肥過(guò)程中，pH值維持在8.0～9.0之間;含水率呈下降趨勢(shì)，堆肥第29 d降至59.7％; C/N呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在堆肥第29 d降到18.3; NH4+-N和NO3--N的含量變化呈相反的趨勢(shì)，NH4+-N在堆肥高溫期達(dá)到最大值(1640 mg/kg)，之后隨著堆肥的進(jìn)行含量逐漸降低;NO3--N的含量在堆肥初期增長(zhǎng)緩慢，在高溫期后迅速

4、增長(zhǎng)，腐熟期達(dá)到最大值(1430 mg/kg)。隨著堆肥天數(shù)的增加，種子發(fā)芽率指數(shù)逐漸上升，在第29 d，發(fā)芽率已經(jīng)達(dá)85％以上，說(shuō)明堆肥已完全腐熟。
　　(2)應(yīng)用克隆文庫(kù)的方法檢測(cè)堆肥中厭氧氨氧化菌，16S rRNA基因的克隆文庫(kù)和hzo基因克隆文庫(kù)的高百分覆蓋率和趨于飽和的稀釋曲線說(shuō)明本研究所構(gòu)建的克隆文庫(kù)能代表該環(huán)境下大部分厭氧氨氧化菌的基因信息?？寺∥膸?kù)分析顯示，在堆肥樣品Day7（高溫期）和Day13（降溫期）中厭氧氨

5、氧化菌多樣性相對(duì)較高，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示堆肥中檢測(cè)到的序列相似于Candidatus Scalindua、Candidatus Brocadia、Candidatus Kuenenia屬的厭氧氨氧化菌。聚類分析顯示，溫度或堆肥時(shí)間相近的樣品群落結(jié)構(gòu)更相似，且堆肥過(guò)程中厭氧氨氧化菌的群落隨著堆肥進(jìn)程發(fā)生了變化。
　　(3)應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)分析堆肥過(guò)程中厭氧氨氧化菌16S rRNA基因的群落變化。結(jié)果表明，各堆肥樣品中均有優(yōu)勢(shì)

6、條帶產(chǎn)生。對(duì)引物Pla46f/Amx368r的DGGE圖譜進(jìn)行UPGMA聚類分析表明，各樣品中之間的群落相似性在0.54～0.86之間;對(duì)引物Amx368f/Amx820r的DGGE圖譜進(jìn)行UPGMA聚類分析表明，各樣品之間的群落相似性在0.35～0.84之間。對(duì)DGGE條帶進(jìn)行主成分分析，顯示堆肥中厭氧氨氧化菌群落結(jié)構(gòu)處于不斷變化中，其中降溫期樣品Day13與其它樣品的群落結(jié)構(gòu)差異較大。對(duì)優(yōu)勢(shì)條帶回收測(cè)序后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果與克

7、隆文庫(kù)結(jié)果相似，主要相似于Candidatus Brocadia、Candidatus Scalindua、CandidatusKuenenia三個(gè)菌屬的厭氧氨氧化菌，在堆肥高溫期主要優(yōu)勢(shì)菌相似于厭氧氨氧化菌屬Candidatus Brocadia，綜合比較兩對(duì)引物檢測(cè)后樣品多樣性結(jié)果，多樣性較高的樣品是Day7（高溫期）和Day13（降溫期）。
　　(4)厭氧氨氧化菌16S rRNA基因的定量PCR結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)樣品的質(zhì)粒為3.68