金黃色葡萄球菌腸毒素B定點突變體活性的研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌腸毒素B(Staphylococcal enterotixn B,SEB)是金黃色葡萄球菌分泌的一種可溶性蛋白質(zhì),屬革蘭氏陽性熱源外毒素,也是一種重要的細菌超抗原.因此微量的SEB就可非特異性地激活5-20%的T細胞,釋放大量的細胞因子,促進CTL細胞成為效應(yīng)細胞并激活NK細胞,從而產(chǎn)生強大的抗腫瘤效應(yīng).但由于SEB具有較大的毒副作用,容易導(dǎo)致人和動物偽膜性小腸炎、大腸炎,引起嘔吐、腹瀉,甚至死亡<'[2]>.為了研究SE

2、B結(jié)構(gòu)中的組氨酸與其毒性的關(guān)系,減輕并消除SEB的毒性作用,促進SEB在腫瘤治療的臨床應(yīng)用.為此,我們通過PCR定點突變技術(shù),在SEB三維結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,用其它氨基酸替代SEB的組氨酸,構(gòu)建六個SEB突變體,并通過一系列實驗檢測各種突變體蛋白的活性.從而篩選出毒副作用較小、超抗原活性較好的突變體.該實驗主要包括兩個部分:1.突變體蛋白的獲得;通過引物設(shè)計及PCR定點引入H12、H32、H105、H121四個突變位點,形成六個突變體:SEB

3、-H12D/H32D、SEB-H105D/H21D、SEB-H12D/H32D/H105D/H121D、SEB-H32D、SEB-H32Q、SEB-H32L.將PCR擴增的突變DNA片段與pET32a原核表達載體連接,構(gòu)建成6個重組表達質(zhì)粒,誘導(dǎo)表達并得到高純度的突變體蛋白.2.突變體蛋白的活性檢測;通過對腫瘤細胞的抑制實驗,脾淋巴細胞增殖實驗以及MHCⅡ親和實驗,初步檢測突變體蛋白的超抗原活性;然后通過幼貓催吐實驗檢測突變體蛋白的毒性

4、,用小鼠致死實驗檢測突變體蛋白在體內(nèi)的超抗原活性作用.在此研究中,我們成功地定點引入了突變位點并構(gòu)建了突變體的原核表達質(zhì)粒,得到了高純度的SEB突變體蛋白(純度>95%).腫瘤細胞的抑制實驗和鼠脾增殖實驗結(jié)果表明:各突變體仍然具有刺激淋巴細胞增殖的能力,并保持了對腫瘤細胞的抑制作用,但與對照組(野生型SEB)相比有所降低.MHCⅡ親和力實驗證明:各突變體蛋白與MHCⅡ類分子均具有較高的親和力,其中四位點突變體(AB)與MHC Ⅱ類分子結(jié)

5、合的熒光強度為220.32,比野生型SEB熒光強度高了一倍;而突變體C3的親和力卻比野生型SEB低了一倍,熒光強度為52.33.催吐實驗顯示:各突變體蛋白均沒有引起實驗動物的嘔吐、腹瀉中毒癥狀.致死實驗表明:所有突變體對小鼠的致死性都有不同程度的降低,尤其是四位點突變體AB(致死率為50%),其致死性比野生型SEB低了一倍;突變體C3具有較高的致死性,但與陽性對照組相比無差異.總之,上述實驗表明:SEB結(jié)構(gòu)中的組氨酸被替代后毒性明顯減弱