PHA基因植物表達載體的構建與轉化研究.pdf

1、為了解決化工合成塑料對環(huán)境造成污染這一難題,開發(fā)和利用生物可降解塑料日益受到人們的重視.聚羥基烷酸(polyhydrocylkanotes PHAs)作為一種大的聚合物,既是許多種細菌的碳源貯存形式,又是一種生物可降解塑料的原料,利用植物生物反應器生產PHA是當前生產生物可降解塑料研究的熱點.該課題組從合成PHA的pseudomanas sp.菌株的亞克隆基因組片段中,分離出phaA、phaB和phaC三個基因片段,定向克隆至原核表達載

2、體pBV220,通過對其生物活性與功能分析,確證了基因phaA、phaB和phaC的生物學功能;為了通過植物生物反應器對這三個基因進一步研究利用,該實驗利用這三個基因構建了兩組可用于不同植物生產PHA的真核表達載體,并對紫葉酢漿草進行PHA基因遺傳轉化的初步研究,獲得主要結果如下:1.利用克隆的phaA、phaB、phaC三個基因分別構建了可用于轉化紫葉酢漿草表達載體pBI121-A、pBI121-B、uBquiting-C;可用于玉米

3、轉化的種子特異性表達載體p7S-A、pBI121-S-B、uBquiting-C.經(jīng)酶切分析、PCR擴增進一步驗證所構建的表達載體是正確的.2.通過對紫葉酢漿草組織培養(yǎng)的研究,初步建立了紫葉酢漿草的再生體系.篩選出誘導愈傷的最佳培養(yǎng)基為MS+2,4-D 1.5mg/L+6-BA 0.1 mg/L;分化的最佳培養(yǎng)基為MS+NAA 0.9 mg/L+6-BA 0.4 mg/L;生根培養(yǎng)基為MS+2,4-D 0.5 mg/L;愈傷組織Kan抗

4、性篩選的最佳濃度為58 mg/L.3.利用基因槍對紫葉酢漿草愈傷組織進行了PHA基因表達載體的遺傳轉化,通過Kan抗性篩選獲得了96株抗性小苗,經(jīng)PCR檢測,其陽性植株率為1.57％.在7株中phaA、phaB單價轉化的分別為一株;含有phaA和phaB基因共轉化一株;含有phaA和phaC基因共轉化一株;含有phaB和phaC基因共轉化兩株;含有phaA和phaB和phaC三個基因共轉化一株.其轉基因株進一步確證快繁擴增、遺傳穩(wěn)定性和