人TPO基因牛體細(xì)胞定點(diǎn)整合載體構(gòu)建與細(xì)胞轉(zhuǎn)染研究.pdf

1、 該研究主要探討人TPO基因牛體細(xì)胞定點(diǎn)整合載體構(gòu)建及其進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染的可行性.參照奶牛、綿羊、山羊等的β-酪蛋白序列設(shè)計了一對引物P1、P2,以本地水牛和內(nèi)蒙古綿羊基因組為模板,采用高保真Ex Taq酶,擴(kuò)增得到水牛、綿羊β-酪蛋白基因的5′調(diào)控區(qū)序列(分別長4.5Kb、4.1Kb).將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD-18T上,經(jīng)酶切分析、部分序列測定和同源比較確認(rèn)得到了所需的基因片段.測序結(jié)果與水牛和綿羊的相應(yīng)序列同源性分別達(dá)到98％(833b

2、p)、98%(735bp).利用已克隆的TPO基因(5.5Kb)、奶牛as1-酪蛋白基因同源臂序列(6.0Kb和1.78Kb)、水牛和綿羊β-酪蛋白5′調(diào)控區(qū)序列和ploxp質(zhì)粒骨架,經(jīng)多步酶切-連接-轉(zhuǎn)化-篩選-鑒定基因重組過程(連接片段不經(jīng)過脫磷酸化處理),最終建成兩個人TPO基因牛體細(xì)胞打靶載體:ploxp-6.0-BβCN-TPO-1.78和ploxp-6.0-SβCN-TPO-1.78,長達(dá)25Kb.采用PCR和酶切分析對構(gòu)建

3、載體進(jìn)行全面驗(yàn)證,確認(rèn)得到了設(shè)計的打靶載體.采用脂質(zhì)體法,將線性化的打靶載體ploxp-6.0-SβCN-TPO-1.78導(dǎo)入體外培養(yǎng)到第3代的奶牛成纖維細(xì)胞,采用G418+GANC進(jìn)行篩選,篩選到第24天時,得到抗性細(xì)胞.結(jié)果表明:(1)應(yīng)用LA-PCR技術(shù),采用高保真Ex Taq酶能擴(kuò)增得到綿羊和水牛beta-casein基因的5′調(diào)控區(qū)序列.(2)綿羊、水牛β-酪蛋白基因的5′調(diào)控區(qū)(啟動子)、人血小板生成素(TPO)基因(目的基