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文檔簡介
1、近年來,受市場需求的刺激,水貂養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展。山東也成為了我國水貂的養(yǎng)殖大省。但是,隨著水貂養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大,一些疫病也成為了制約水貂養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素。水貂阿留申?。ˋD),作為毛皮動物三大疫病之一,會造成水貂的毛皮質量的下降,對養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。但是,目前,還沒有專門的藥物或者疫苗來防治此病,只能通過檢疫淘汰病貂達到對貂群的凈化。因此,研究水貂阿留申病毒(ADV)在山東地區(qū)的分子生物學特點,建立一種特異性的檢測方法具有重要
2、意義。
本研究對檢測到的患水貂阿留申病的水貂臟器進行研磨,將研磨液接種到貓腎細胞(CRFK)中分離培養(yǎng)。當細胞出現(xiàn)穩(wěn)定的病變后,提取細胞DNA進行PCR檢測,結果呈現(xiàn)阿留申陽性。將擴增的序列進行測序,與參考序列ADV-G比對后,核苷酸同源性達到92.6%。但是,隨著病毒傳代次數(shù)的增加,細胞病變逐漸消失,PCR檢測呈現(xiàn)陰性。說明該病毒不能在貓腎細胞中穩(wěn)定傳代。時,我們對從山東省諸城某水貂養(yǎng)殖場采集的134份水貂實質器官進行檢測,
3、發(fā)現(xiàn)有37株呈現(xiàn)水貂阿留申病陽性,陽性率達到27.6%。對37株水貂阿留申病毒進行VP2基因的擴增并進行序列測定。用生物軟件分析后發(fā)現(xiàn),37株測序株間VP2基因核苷酸相似性為88%-99.8%,與GenBank中參考序列的相似性為88.0%-100%。并且,我們觀察到:山東地區(qū)水貂阿留申病毒VP2基因存在大量的突變位點。將測序株與參考株經(jīng)進化樹分析后,分成5個分支(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)。VP2基因進化樹顯示89%的國內(nèi)毒株處在進化樹的第
4、Ⅰ和第Ⅴ分支,而這兩個分支不包含國外毒株。其中,有78.4%的毒株處在第Ⅰ分支。余下的11%的國內(nèi)毒株則與其他國外毒株有較近的親緣關系。這說明我國水貂阿留申病毒已經(jīng)有別于國外毒株,形成了自己的獨立進化支。由于大多數(shù)分離到的毒株處于第Ⅰ分支,我們暫且認為可能山東地區(qū)的毒株在向第Ⅰ分支進化的趨勢。這對找出本地區(qū)流行的水貂阿留申病毒的標準毒株,以便進行對該病的檢測提供科學依據(jù)。為了進一步研究分離到的37株病毒VP2基因的分子特征,用DNAST
5、AR軟件分別推導出各基因片段的氨基酸序列,并與參考毒株進行比較分析。結果發(fā)現(xiàn):測序株間氨基酸的相似性為89.2%-99.7%,與參考序列間的相似性87.7%-100%??v觀VP2的整個氨基酸序列中,突變較多,有超過100多個氨基酸的突變。突變較集中的區(qū)域有三個,其中包括免疫反應區(qū)VP2:429-524。有14個突變位點只存在于中國毒株。其中,位點204:V-I、305:K-T、308:T-S、419:L-I、436:I-M的突變,突變毒
6、株超過10個。419:L-I、436:N-D兩個突變存在于VP2:428-446區(qū)域,而該區(qū)域可能影響水貂阿留申病毒的宿主范圍的選擇(McKenna et al.,1999)。對于其它幾個頻率較高的突變,我們目前還沒有確切的研究來表明它突變的意義。其次,本實驗室針對VP2序列的高免疫反應區(qū)(430-525)進行原核表達,并建立了間接ELISA檢測方法。將擴增出的序列與pET-32a原核表達載體連接,在大腸桿菌BL21中進行表達。當誘導劑
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