不同日糧模式及長(zhǎng)鏈脂肪酸對(duì)奶牛乳腺乳脂合成的影響及其機(jī)理研究.pdf

1、本論文主要研究不同模式日糧對(duì)奶牛乳腺中乳脂合成影響及長(zhǎng)鏈脂肪酸添加對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的乳脂合成影響機(jī)理，通過體外的長(zhǎng)鏈脂肪酸添加試驗(yàn)研究動(dòng)物試驗(yàn)中脂肪酸合成及長(zhǎng)鏈脂肪酸的變化機(jī)理。探討長(zhǎng)鏈脂肪酸的最佳組合對(duì)乳脂的合成影響變化，為完善乳脂的代謝模型提供依據(jù)，并為改善牛奶的品質(zhì)提供理論依據(jù)。本論文主要包括四個(gè)試驗(yàn):
　　1.試驗(yàn)一采用完全隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將30頭牛隨機(jī)分為三個(gè)組，每個(gè)組10頭。三組的試驗(yàn)日糧分別是:1）混合粗飼料組(

2、IMF)，精粗比為46∶54;2）高精料秸稈組(CS1)，精粗比為65∶35，其營(yíng)養(yǎng)水平與IMF組相近;3）低精料秸稈組(CS2)，精粗比為46∶54。本試驗(yàn)共進(jìn)行三期，每期21天，其中14天為適應(yīng)期，7天為樣品采集期，在試驗(yàn)最后一天采集乳腺組織進(jìn)行乳脂合成相關(guān)基因表達(dá)影響研究。試驗(yàn)結(jié)果為在營(yíng)養(yǎng)水平較低日糧(CS2)組奶牛的乳產(chǎn)量顯著低于營(yíng)養(yǎng)水平較高日糧組(IMF和CS1)奶牛的乳產(chǎn)量。乳脂，乳蛋白和總固型物含量在IMF都為最高。飽和脂

3、肪酸和短鏈脂肪酸在IMF組含量最高，單不飽和脂肪酸(MUFA)和長(zhǎng)鏈脂肪酸(LCFA)在CS2組最高，而多不飽和脂肪酸(PUFA)在CS1組最高。乳脂合成相關(guān)基因FASN、SCD、LPL和CD36在IMF的表達(dá)量均高于秸稈組，但脂肪酸網(wǎng)絡(luò)調(diào)控基因沒有顯著影響。
　　2.將試驗(yàn)一中所采集的乳腺組織進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)奶牛乳腺組織的整體轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行研究，進(jìn)一步研究日糧對(duì)奶牛乳腺組織轉(zhuǎn)錄組中乳脂及乳蛋白差異基因表達(dá)豐度的影響。試驗(yàn)結(jié)

4、果證明我們的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)完全符合進(jìn)一步分析的要求。在對(duì)預(yù)測(cè)基因進(jìn)行COG功能分類預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)共有18828個(gè)Unigene被注釋上25種COG分類。其中關(guān)于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制功能的最多，其中關(guān)于脂類轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝功能的有877個(gè)Unigene，關(guān)于氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝功能的共有595個(gè)Unigene。在對(duì)Unigene進(jìn)行GO功能分類預(yù)測(cè)，有211947個(gè)Unigene被注釋上GO分類，其中共有96295個(gè)歸為生物學(xué)過程(Biological Proce

5、ss)，共有77729個(gè)歸為細(xì)胞成分(CellularComponent)，共有37950個(gè)歸為分子功能(Molecular Function)。在KEGG對(duì)脂類代謝通路進(jìn)行分析后得出，IMF組的脂肪酸生物合成通路中基因豐度值都顯著高于CS組，而脂肪酸延伸和不飽和脂肪酸合成通路中基因豐度值都顯著低于CS組，與乳脂含量及濃度的趨勢(shì)相一致。
　　3.由于前期動(dòng)物試驗(yàn)中不同日糧模式對(duì)乳脂中長(zhǎng)鏈脂肪酸有顯著影響，為進(jìn)一步研究長(zhǎng)鏈脂肪酸變化

6、對(duì)乳脂的影響機(jī)理，我們?cè)隗w外以奶牛乳腺上皮細(xì)胞為模型，進(jìn)行單一長(zhǎng)鏈脂肪酸添加，測(cè)定乳腺上皮細(xì)胞的增殖能力，從每種脂肪酸添加濃度中篩選出不能對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制作用的四個(gè)濃度梯度，進(jìn)行三種不飽和脂肪酸(UFA)的正交試驗(yàn)(L16(43))和五種長(zhǎng)鏈脂肪酸(LCFA)的正交試驗(yàn)(L16(45))。采用甘油三脂試劑盒對(duì)細(xì)胞中甘油三酯含量進(jìn)行測(cè)定，確定出三種不飽和脂肪酸的最佳濃度組合為100μM油酸、100μM亞油酸和1.4μM亞麻酸，五種長(zhǎng)鏈脂

7、肪酸的最佳濃度組合為100μM棕櫚酸、5μM硬脂酸、100μM油酸、25μM亞油酸和1.2μM亞麻酸。發(fā)現(xiàn)三種UFA中對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞甘油三酯合成影響的順序?yàn)?C18∶3＞C18∶2＞C18∶1，五種LCFA中對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞甘油三酯合成影響的順序?yàn)?C18∶0＞C18∶2＞C18∶3＞C18∶1＞C16∶0。添加長(zhǎng)鏈脂肪酸對(duì)細(xì)胞中的甘油三脂含量有顯著促進(jìn)作用，且添加飽和長(zhǎng)鏈脂肪酸后的促進(jìn)效果更顯著。而對(duì)基因表達(dá)的影響結(jié)果是LCFA

8、組的FASN表達(dá)量最低，而CD36和PPARG表達(dá)量最高;對(duì)照組的SCD和ACSL1表達(dá)量最低;UFA組的SREBF1和AGPAT6表達(dá)量最低。在細(xì)胞中LCFA組的中短鏈脂肪酸(SMFA)含量最低而UFA含量最高，對(duì)照組的SFA含量最高，培養(yǎng)基中C18∶0在UFA組中顯著高于LCFA組。
　　4.將五種脂肪酸添加的最佳組合逐一回撤研究其對(duì)乳脂合成的影響。對(duì)處理組進(jìn)行甘油三脂含量，細(xì)胞中乳脂合成相關(guān)基因表達(dá)量及細(xì)胞和培養(yǎng)基中的脂肪酸

9、含量的測(cè)定。結(jié)果顯示回撤長(zhǎng)鏈脂肪酸對(duì)甘油三脂合成的影響結(jié)果與前期試驗(yàn)結(jié)果一致，即硬脂酸是對(duì)甘油三脂合成影響最大的長(zhǎng)鏈脂肪酸?；爻吩囼?yàn)對(duì)從頭合成基因ACACA和FASN基因沒有顯著影響。回撤亞麻酸對(duì)細(xì)胞中FABP3、ACSL1和SREBF1有顯著升高作用，回撤C16∶0對(duì)LPL表達(dá)量顯著提高。在細(xì)胞中SMFA在對(duì)照組中的含量最高，LCFA的含量最低?；爻稢18∶3n3后SFA含量最高，UFA含量最低。在培養(yǎng)基中回撤C16∶0后LCFA含量

10、最高。回撤C18∶0后SFA含量最高，UFA含量最低。
　　綜合本試驗(yàn)的研究結(jié)果可以得出，營(yíng)養(yǎng)平衡日糧可以提高泌乳奶牛乳產(chǎn)量、乳脂和乳蛋白含量以及一些乳脂合成相關(guān)基因的表達(dá)，從轉(zhuǎn)錄水平上可以驗(yàn)證乳脂含量及組成的結(jié)果。通過體外長(zhǎng)鏈脂肪酸添加可以提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞甘油三脂含量，降低細(xì)胞從頭合成基因，提高轉(zhuǎn)運(yùn)基因和網(wǎng)絡(luò)調(diào)控基因的表達(dá)，使細(xì)胞中的中短鏈脂肪酸含量降低，不飽和脂肪酸含量升高，硬脂酸對(duì)甘油三脂合成影響最大，五種長(zhǎng)鏈脂肪酸對(duì)從