棉鈴蟲(chóng)與甜菜夜蛾幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)對(duì)Cry1Ac與Cry1Ca的敏感性及其機(jī)制.pdf

1、棉鈴蟲(chóng)是棉花蕾鈴期的害蟲(chóng)，寄主植物有20多科200余種，廣泛分布在中國(guó)及世界各地，黃河流域棉區(qū)、長(zhǎng)江流域棉區(qū)受害較重。甜菜夜蛾是一種世界性分布、間歇性大發(fā)生的以危害蔬菜為主的雜食性害蟲(chóng)。由于近年來(lái)中國(guó)的Bt棉商業(yè)化廣泛種植，甜菜夜蛾憑借廣泛的分布已經(jīng)成為棉花上的主要害蟲(chóng)。
　　蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)及其毒素蛋白轉(zhuǎn)入植物或制成生物農(nóng)藥，在各地廣泛應(yīng)用于棉花害蟲(chóng)的防治。然而，在研究和應(yīng)用過(guò)程中，

2、一些尚未解決和新出現(xiàn)的問(wèn)題逐漸積累，影響其進(jìn)一步推廣。本文擬比較研究?jī)煞N毒素Cry1AC和Cry1Ca對(duì)甜菜夜蛾和棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)的毒力，以及產(chǎn)生毒力差異的毒理學(xué)機(jī)理。
　　1.棉鈴蟲(chóng)和甜菜夜蛾成蟲(chóng)對(duì)Cry1Ac和Cry1Ca的毒理學(xué)研究
　　將活化的Cry1Ac和Cry1Ca毒素溶解在10％蔗糖水溶液中，配制成濃度分別為500、100和20μg/ml的毒素溶液。飼喂500μg/ml的Cry1Ac和Cry1Ca溶液后，棉鈴蟲(chóng)

3、雌蟲(chóng)的壽命分別縮短了48.1％和48.9％，甜菜夜蛾雌蟲(chóng)的壽命分別縮短了43.5％和38.5％;棉鈴蟲(chóng)雄蟲(chóng)的壽命分別縮短了37.8％和40.3％，甜菜夜蛾雄蟲(chóng)的壽命分別縮短了50.5％和47.4％。濃度為500μg/ml的Cry1Ac和Cry1Ca大幅降低了棉鈴蟲(chóng)雌蟲(chóng)精包接受率50.0％和46.8％，以及甜菜夜蛾雌蟲(chóng)精包接受率的58.7％和57.3％;顯著降低棉鈴蟲(chóng)雄蟲(chóng)的精包形成率的40.0％和50.3％，以及甜菜夜蛾雄蟲(chóng)的精包形成率的

4、61.3％和60.0％。在500μg/ml的Cry1Ac和Cry1Ca影響下，棉鈴蟲(chóng)雌蟲(chóng)的產(chǎn)卵量顯著降低57.5％和57.5％，甜菜夜蛾雌蟲(chóng)的卵塊數(shù)量降低35.4％和45.8％。飼喂Cry1Ac和Cry1Ca都不影響卵孵化率。在濃度為100和20μg/ml時(shí)，Cry1Ac和Cry1Ca對(duì)昆蟲(chóng)壽命和交配基本不影響。
　　2.3種Cry毒素與7種蛋白酶抑制劑對(duì)甜菜夜蛾的協(xié)同增效作用
　　甜菜夜蛾幼蟲(chóng)中腸液可以有效降低Cry1Ac

5、、Cry1Ab和Cry1Ca的活性。測(cè)定了3種Cry毒素和7種蛋白酶抑制劑（苯甲基磺酰氟PMSF、大豆胰蛋白酶抑制SBTI、乙二胺四乙酸EDTA、對(duì)甲苯磺酰-L-苯丙氨酸氯甲基酮TPCK、對(duì)甲苯磺酰-L-賴(lài)氨酸氯甲基酮TLCK、單寧酸Tanic acid，彈性蛋白酶抑制劑）混合使用對(duì)幼蟲(chóng)生長(zhǎng)的影響。單獨(dú)用抑制劑或毒素(Cry1Ac，31.30ng/cm2;Cry1Ab，3.2ng/cm2;Cry1Ca，0.6ng/cm2)連續(xù)六天飼喂二

6、齡初幼蟲(chóng)只能輕微的影響幼蟲(chóng)生長(zhǎng)。飼喂含有一種抑制劑和一種毒素的混合溶液，除EDTA外，均能夠協(xié)同作用降低幼蟲(chóng)的體重。而且抑制劑濃度越高抑制效果越明顯。表明甜菜夜蛾幼蟲(chóng)中腸內(nèi)的胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶和類(lèi)彈性蛋白酶與3種活化Cry毒素的水解相關(guān)。
　　3.甜菜夜蛾絲氨酸蛋白酶基因的分子克隆及序列分析
　　利用甜菜夜蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)和RT-PCR技術(shù)得到甜菜夜蛾中腸絲氨酸蛋白酶的6個(gè)基因全長(zhǎng)序列，經(jīng)過(guò)序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，這

7、6個(gè)基因與家蠶絲氨酸蛋白酶家族的基因有很高的相似性，證明這6個(gè)基因序列是甜菜夜蛾中腸的絲氨酸蛋白酶基因序列。
　　4.棉鈴蟲(chóng)和甜菜夜蛾鈣粘蛋白時(shí)間表達(dá)及絲氨酸蛋白酶活性測(cè)定
　　測(cè)定了鈣粘蛋白基因在棉鈴蟲(chóng)與甜菜夜蛾各個(gè)蟲(chóng)態(tài)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)鈣粘蛋白基因在甜菜夜蛾幼蟲(chóng)5齡期表達(dá)量最高，蛹期和成蟲(chóng)期基本不表達(dá)。鈣粘蛋白基因在棉鈴蟲(chóng)6齡幼蟲(chóng)期表達(dá)量最高，蛹期和成蟲(chóng)期基本不表達(dá)。推測(cè)Bt對(duì)棉鈴蟲(chóng)和甜菜夜蛾的成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)的毒力差異可能是由于B