畢業(yè)論文-生物預(yù)處理秸稈轉(zhuǎn)化能源的初步研究

1、<p>　　生物預(yù)處理秸稈轉(zhuǎn)化能源的初步研究</p><p>　　系 （部）：XXXXXXXXX</p><p>　　專 業(yè) 班：XXXXXXX</p><p>　　姓 名：XXX</p><p>　　學(xué) 號(hào)：XXXXXXXX</p><p><b>　　指導(dǎo)教師：XXX</b&g

2、t;</p><p><b>　　2013年 5月</b></p><p>　　生物預(yù)處理秸稈轉(zhuǎn)化能源的初步研究</p><p>　　A Preliminary Study of The Biological Pretreatment Straw to Energy</p><p><b>　　摘 要<

3、/b></p><p>　　白腐菌是目前已知的降解木質(zhì)素最強(qiáng)的微生物，但白腐菌直接對(duì)秸稈進(jìn)行預(yù)處理所得到的糖化率和乙醇的產(chǎn)量并不高。國(guó)外研究顯示，利用白腐菌對(duì)秸稈等草類原料進(jìn)行固體發(fā)酵處理，可以對(duì)木質(zhì)素進(jìn)行選擇性降解，直接攻擊胞間層中的木質(zhì)素，導(dǎo)致纖維的分離。目前，國(guó)內(nèi)利用白腐菌的生物降解研究大都處于實(shí)驗(yàn)室階段。</p><p>　　前期研究通過(guò)對(duì)自然界微生物天然腐朽過(guò)程的模擬和改造

4、，建立了一個(gè)可用于秸稈轉(zhuǎn)化乙醇、油脂等生物能源的仿生預(yù)處理系統(tǒng)，該系統(tǒng)的處理效率是目前同類報(bào)道中最高的。為了顯著提高白腐菌秸稈預(yù)處理優(yōu)化所得的糖化率，本研究對(duì)白腐菌預(yù)處理秸稈的這一系統(tǒng)進(jìn)行了條件優(yōu)化以增強(qiáng)系統(tǒng)穩(wěn)定性，為其工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容包括：開(kāi)放條件下生物預(yù)處理研究；生物預(yù)處理體系穩(wěn)定性的研究；影響生物預(yù)處理穩(wěn)定性的主要因素。論文選擇改變白腐菌預(yù)處理秸稈系統(tǒng)的培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、是否通氧以及培養(yǎng)基中K+、Mn2+、Ca2

5、+、Cu2+等離子的添加，采用分光光度計(jì)計(jì)算測(cè)定其糖化率，得到可以提高白腐菌預(yù)處理秸稈產(chǎn)生的還原糖的量的5個(gè)優(yōu)化的因子,即：在28℃溫度條件下培養(yǎng)4周、通氧并添加低濃度Mn2+離子，提供更高的培養(yǎng)基濕度，可以提高白腐菌預(yù)處理秸稈轉(zhuǎn)化能源的效率。</p><p>　　關(guān)鍵詞：白腐菌 秸稈預(yù)處理 優(yōu)化 糖化率</p><p>　　Abstract </p><p>　

6、　Because of reduced energy and less pollution, biological pretreatment attracts a wide spread attention.The biological degradation of lignin in corn straw with white rot fungi is the most effective fungi among Microbe.Ov

7、erseas studies have shown that white rot fungi the solid fermentation processing the raw material of straw and other grasses, selective degradation of lignin, a direct attack on the lignin in the cell between layers, res

8、ulting in separation of the fiber.Currently,the domestic use </p><p>　　Key words: white rot fungi pretreatment optimization saccharification rate</p><p><b>　　目 錄</b></p>&

9、lt;p><b>　　摘要Ⅰ</b></p><p>　　AbstractⅡ</p><p><b>　　1 緒論1</b></p><p>　　1.1 秸稈的利用現(xiàn)狀和結(jié)構(gòu)特征1</p><p>　　1.1.1 木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)和組成1</p><p>

10、;　　1.1.2 木質(zhì)纖維素的生物降解與酶解2</p><p>　　1.2 白腐菌及其研究3</p><p>　　1.2.1 白腐菌簡(jiǎn)介3</p><p>　　1.2.2 白腐菌降解研究進(jìn)展4</p><p>　　1.3 秸稈預(yù)處理技術(shù)5</p><p>　　1.3.1 理化預(yù)處理工藝5<

11、/p><p>　　1.3.2 生物預(yù)處理工藝6</p><p>　　1.3.3 秸稈白腐菌預(yù)處理及存在的問(wèn)題6</p><p>　　1.3.4 纖維質(zhì)乙醇的研究及其存在的技術(shù)屏障6</p><p>　　1.4 課題思路的提出與設(shè)計(jì)7</p><p>　　1.4.1 課題設(shè)計(jì)路線7</p>

12、<p>　　1.4.2 因子的選擇7</p><p>　　2 白腐菌預(yù)處理秸稈溫度和通氧的優(yōu)化8</p><p>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料8</p><p>　　2.1.1 菌株8</p><p>　　2.1.2 纖維素酶8</p><p>　　2.1.3 主要藥品與試劑8</p&g

13、t;<p>　　2.1.4 生物質(zhì)來(lái)源與準(zhǔn)備8</p><p>　　2.1.5 培養(yǎng)基8</p><p>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法9</p><p>　　2.2.1 菌株的活化與制備9</p><p>　　2.2.2 白腐菌預(yù)處理秸稈的不同溫度和氧氣條件9</p><p>　　2.2.3

14、 取樣時(shí)間與方法9</p><p>　　2.2.4 生物質(zhì)酶解糖化9</p><p>　　2.2.5 還原糖測(cè)定方法10</p><p>　　2.2.6 木質(zhì)纖維素含量測(cè)定12</p><p>　　2.3 結(jié)果與分析12</p><p>　　3 白腐菌預(yù)處理秸稈多因子的進(jìn)一步優(yōu)化14</p&

15、gt;<p>　　3.1 實(shí)驗(yàn)材料14</p><p>　　3.1.1 菌株14</p><p>　　3.1.2 纖維素酶14</p><p>　　3.1.3 主要藥品與試劑14</p><p>　　3.1.4 生物質(zhì)來(lái)源與準(zhǔn)備14</p><p>　　3.1.5 培養(yǎng)基14<

16、;/p><p>　　3.2 實(shí)驗(yàn)方法16</p><p>　　3.2.1 菌株的活化與制備16</p><p>　　3.2.2 白腐菌預(yù)處理秸稈的不同因子培養(yǎng)基的處理16</p><p>　　3.2.3 取樣時(shí)間與方法16</p><p>　　3.2.4 生物質(zhì)酶解糖化16</p><

17、;p>　　3.2.5 還原糖測(cè)定方法17</p><p>　　3.2.6 木質(zhì)纖維素含量測(cè)定18</p><p>　　3.3 結(jié)果與分析19</p><p><b>　　結(jié)論21</b></p><p><b>　　致謝22</b></p><p>&l

18、t;b>　　參考文獻(xiàn)23</b></p><p><b>　　附錄25</b></p><p><b>　　1 緒 論</b></p><p>　　1.1 秸稈的利用現(xiàn)狀和結(jié)構(gòu)特征</p><p>　　我國(guó)農(nóng)作物秸稈資源大部分被作為農(nóng)戶生活燃料或在田間焚燒或被棄置亂堆,不僅造成

19、了秸稈資源的嚴(yán)重浪費(fèi),而且還導(dǎo)致了環(huán)境的污染。通過(guò)對(duì)全國(guó)的秸稈資源產(chǎn)量及分布狀況的調(diào)查與分析,可知不同種類的秸稈產(chǎn)量及分布有明顯的地區(qū)性差異。全國(guó)各種主要作物秸稈占總量的比例順序?yàn)?稻谷秸稈最高,其次是玉米秸稈和小麥秸。全國(guó)秸稈產(chǎn)量超過(guò)2500萬(wàn)噸的省份有山東、河南等8個(gè)。此外,對(duì)8個(gè)省市秸稈利用現(xiàn)狀的調(diào)查研究結(jié)果表明：目前各類秸稈用作燃料的比例仍較高,用作飼料和肥料的比例有所增加,但焚燒、棄置亂堆的現(xiàn)象仍然存在;秸稈用于飼料的比例以甘

20、肅、山東、青海3省最高,超過(guò)了25%。通過(guò)對(duì)全國(guó)草食家畜存欄量及粗飼料產(chǎn)量的草畜平衡分析可看出,目前我國(guó)的粗飼料缺口較大,僅靠人工種草和天然草地的牧草供給是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。因此,利用秸稈來(lái)補(bǔ)充短缺的粗飼料以保證畜牧業(yè)的穩(wěn)定持續(xù)發(fā)展就顯得十分重要。針對(duì)我國(guó)秸稈利用現(xiàn)狀,作者提出了因地制宜、依靠先進(jìn)的現(xiàn)代科技來(lái)利用秸稈資源,提高秸稈的利用率、擴(kuò)大秸稈的利用途徑、增加秸稈的附加值,從而有效滿足畜牧業(yè)的發(fā)展需求。</p><p&

21、gt;　　狹義上，生物質(zhì)（biomass）指木質(zhì)纖維素類物質(zhì)，它們是地球上最豐富的光合產(chǎn)物，來(lái)源非常廣泛，包括所有植物的根、莖、葉、果殼等部分。生物質(zhì)產(chǎn)量大且類型多，農(nóng)作物秸稈是其主要來(lái)源之一。我國(guó)農(nóng)作物秸稈、皮殼等產(chǎn)量每年高達(dá)7億多噸，資源十分豐富，其中玉米秸稈、小麥秸稈和稻草是最主要的三大秸稈[1]，僅玉米秸稈年產(chǎn)量大約3億噸。目前，大量的農(nóng)作物秸稈除少部分被利用外，大部分以堆積、焚燒等形式直接傾入環(huán)境，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染與資源浪費(fèi)

22、。秸稈作為地球上豐富的可再生資源,其成分主要是木質(zhì)素、纖維素、半纖維素 [2]。</p><p>　　1.1.1 木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)和組成</p><p>　　木質(zhì)纖維素（lignocellulose）是生物質(zhì)的主要組分，由纖維素（cellulose）、半纖維素（hemicellulose）和木質(zhì)素（lignin）三種成分以各種比例組成的高分子復(fù)合物，不同組分含量比例因生物質(zhì)種類而異[3]。

23、</p><p>　　木質(zhì)素是由苯丙烷結(jié)構(gòu)單元通過(guò)醚鍵和碳-碳鍵連接而成的具有三維空間結(jié)構(gòu)的高分子芳香類聚合物, 難以被酸水解,對(duì)酶的水解呈抗性,是公認(rèn)的難降解物質(zhì)[4]。木質(zhì)素廣泛存在于較高等的維管束植物中，與纖維素、半纖維素合稱為植物體的“三素”，在自然界的含量?jī)H次于纖維素。</p><p>　　纖維素是由β-1,4-糖苷鍵連接D-葡萄糖單元構(gòu)成的無(wú)分支長(zhǎng)鏈狀大分子，聚合度大（一般為1

24、000～10000），結(jié)構(gòu)緊密。纖維素在化學(xué)組成上的重復(fù)單元為葡萄糖。纖維素大分子間的結(jié)合鍵主要是氫鍵、范德華力和碳氧鍵。纖維素是豐富的、可再生的天然資源，除紡織、制漿造紙等傳統(tǒng)領(lǐng)域外，采用新技術(shù)制備高附加值產(chǎn)品的研究方興未艾，已在食品、醫(yī)藥、材料等領(lǐng)域開(kāi)展了許多工作[5]。</p><p>　　半纖維素基本單位是多種戊糖和己糖單體，包括甘露糖、木糖、半乳糖醛、葡萄糖、葡萄糖糖醛酸等。這些單體以不同連接方式組成低

25、分子量的不均一聚糖[6]。</p><p>　　纖維素分子是木質(zhì)纖維素的主要框架結(jié)構(gòu)，半纖維素和木質(zhì)素充斥于纖維骨架之間，將纖維素包裹其中。木質(zhì)素結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，與半纖維素一起填充于纖維素之間或包埋纏繞于其外起加固粘結(jié)的作用，不宜通過(guò)水解方式降解，對(duì)絕大多數(shù)微生物的攻擊均有抗性。在木質(zhì)纖維素原料中，纖維素、半纖維素和木質(zhì)素以共價(jià)鍵及非共價(jià)鍵緊密連結(jié)，形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。</p><p>　　

26、1.1.2 木質(zhì)纖維素的生物降解與酶解</p><p>　　纖維素酶(cellulase)是纖維素水解為葡萄糖過(guò)程中起到催化作用的各種酶的總稱，因此也被叫做纖維素酶系[7]。從功能方面來(lái)看，纖維素酶包括：（1）內(nèi)切葡萄糖苷酶，作用于纖維素內(nèi)部的β-1,4-糖苷鍵，從纖維素鏈上釋放出更多的葡萄糖末端；（2）外切葡萄糖苷酶，作用于纖維素中還原以及非還原位的糖苷鍵，生成纖維二糖；（3）纖維二糖酶,作用于纖維二糖使之水解

27、為葡萄糖。只有在纖維素酶系中這三類酶的共同作用,最終才能把木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)內(nèi)的纖維素水解變成葡萄糖。</p><p>　　在纖維乙醇生產(chǎn)中，纖維素酶對(duì)木質(zhì)纖維素原料的酶解效率至關(guān)重要。自然界中木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的完全生物降解涉及許多種微生物的作用和酶反應(yīng)機(jī)制。木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)特征，即木質(zhì)素和半纖維素對(duì)纖維素分子的包埋作用（主要是木質(zhì)素）及纖維素分子自身的超分子結(jié)構(gòu)，使纖維素免遭外界化學(xué)物質(zhì)或生物酶攻擊[8]。必須通過(guò)一

28、定的預(yù)處理手段來(lái)去除半纖維素和木質(zhì)素，降低纖維素的結(jié)晶度，增大纖維素酶的有效接觸面積，從而提高木質(zhì)纖維素的酶解效率。研究表明，高等真菌，尤其是白色腐朽類的白腐菌，蘊(yùn)藏著豐富的木質(zhì)素氧化酶系，是自然界中高效降解木質(zhì)素的生力軍[9]。研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)7種真菌處理后的木材酶水解率有明顯提高，且最大的提高了4.27倍[10]。</p><p>　　1.2 白腐菌及其研究</p><p>　　1.2.

29、1 白腐菌簡(jiǎn)介</p><p>　　白腐菌是一種能夠引起木材白色腐朽的擔(dān)子菌類。在所有的能降解木素質(zhì)的微生物中,白腐菌是目前研究最充分的、對(duì)木質(zhì)素具有最強(qiáng)降解能力的一類真菌[11]。它可以直接侵入木材的細(xì)胞腔內(nèi)，釋放降解木質(zhì)素和其它組分（纖維素、半纖維素、果膠等）的酶，導(dǎo)致木材腐爛成白色海綿狀團(tuán)塊，故因此而得名。分類上屬于真菌界，絕大多數(shù)為擔(dān)子菌，少數(shù)為子囊菌，包括多孔菌、側(cè)耳、香菇等200多個(gè)品系。白腐菌的特點(diǎn)

30、是對(duì)于木質(zhì)纖維原料中木質(zhì)素的選擇降解能力是最強(qiáng)的，白腐菌分泌的LiP，MnP，Laccase及多酚氧化酶可以將木質(zhì)素徹底的礦化成二氧化碳和水，當(dāng)然白腐菌對(duì)纖維素和半纖維素也有一定的降解能力[12]。</p><p>　　白腐菌屬于擔(dān)子菌綱(Basidiomycete)，是少數(shù)的能選擇性降解木質(zhì)素的真菌之一，因其腐生在樹(shù)木或木材上，引起木質(zhì)白色腐爛而得此名。目前，已研究的白腐菌有：黃孢原毛平革菌(Phaneroch

31、aete chrysosporium)、彩絨革蓋菌(Coliolus versicolor)、變色栓菌(Trametes versicolor)、射脈菌(Phlebia radiata)、鳳尾菇(Pleurotus pulm onarius)、雜色云芝(Trametes versicolor)、糙皮側(cè)耳(Pleurotus)、朱紅密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus)等。P.chrysosporium 已成為研究木質(zhì)素

32、降解的模式菌株[13]。白腐菌所分泌的木質(zhì)素降解酶主要有3種，即木質(zhì)素過(guò)氧化酶、錳過(guò)氧化物酶和漆酶。白腐菌在降解木材的過(guò)程中，在適宜的條件下，白腐菌菌絲開(kāi)始沿著細(xì)胞腔蔓延，主要集中在紋孔處。在菌絲下細(xì)胞壁被分解出一條溝槽，它可從細(xì)胞腔到復(fù)合胞間層，逐漸降解纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。白腐菌降解木質(zhì)素可分為細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外2個(gè)過(guò)程。在細(xì)胞內(nèi)主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(碳、氮、硫)限</p><p>　　1.2.2 白腐菌降解研究進(jìn)展

33、</p><p>　　自然界參與降解木質(zhì)素的微生物種類有真菌、放線菌和細(xì)菌等，但迄今為止最有效、最主要的木質(zhì)素降解微生物，可徹底降解木質(zhì)素為CO2和H2O的是白腐真菌。以木材的腐朽類型，木質(zhì)纖維素降解真菌可分為3類：白腐菌(White rot fungi)、褐腐菌(Brown rot fungi)和軟腐菌(Soft rot fungi) [16]。其中褐腐菌只能攻擊和降解細(xì)胞壁中的纖維素、半纖維素部分，而軟腐菌僅

34、作用于細(xì)胞中的半纖維素，只有白腐菌是自然界中唯一一類具有獨(dú)立降解木質(zhì)素能力的微生物，褐腐菌、軟腐菌一般認(rèn)為在木素降解中僅起二次性作用。白腐菌分泌木質(zhì)素降解酶的同時(shí)還分泌纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶等酶類，因而比木霉、曲霉等更適合分解天然的木質(zhì)纖維素物質(zhì)。纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分，廣泛而大量地存在于自然界，是地球上最豐富、最廉價(jià)的可再生資源，也是人類未來(lái)可能的能源、食品和化工原料的主要來(lái)源。利用纖維素酶將纖維原料轉(zhuǎn)化成可利用的糖，對(duì)于

35、可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的實(shí)施具有重大意義[17]。</p><p>　　目前白腐菌降解木質(zhì)素的模式菌株是黃孢原毛平革菌。秸稈經(jīng)白腐真菌發(fā)酵后，大部分的低質(zhì)非蛋白氮轉(zhuǎn)化為較高質(zhì)量的菌體蛋白，蛋白質(zhì)品質(zhì)也得到較大幅度的改進(jìn)。秸稈經(jīng)白腐菌處理不僅營(yíng)養(yǎng)成分有極大的提高，而且其pH值由未處理前的5.7降到4.0，呈愉快的水果香味，同時(shí)由于大部分的木質(zhì)素被降解或破壞，秸稈質(zhì)地柔軟，適口性明顯改善；可提高動(dòng)物對(duì)飼料的消化，并且已經(jīng)突破

36、了秸稈僅用于反芻動(dòng)物飼料的禁區(qū)，對(duì)飼養(yǎng)豬、雞的實(shí)驗(yàn)效果已有報(bào)道。利用白腐真菌處理秸稈能夠快速、高質(zhì)量地利用和轉(zhuǎn)化秸稈資源，擴(kuò)大飼料來(lái)源，減少環(huán)境污染[18]。白腐菌的木素降解酶類能選擇分解植物秸稈中的木質(zhì)素，使得生物制漿成為可能。生物制漿是直接利用微生物降解纖維原料中的木質(zhì)素，分離出纖維，使之成為紙漿[19]。這種方法不僅能節(jié)約能耗，改善紙張的物理性能，還能減少污染，保護(hù)環(huán)境，應(yīng)用前景廣闊。隨著對(duì)木質(zhì)素降解機(jī)理認(rèn)識(shí)的深入，白腐菌在生物制

37、漿、生物漂白、染料脫色、木質(zhì)素轉(zhuǎn)化、食品飲料、飼料原料以及廢水、廢物處理等方面將發(fā)揮重要作用[20]。</p><p>　　國(guó)外研究顯示，利用白腐菌對(duì)秸稈等草類原料進(jìn)行固體發(fā)酵處理，可以對(duì)木質(zhì)素進(jìn)行選擇性降解，直接攻擊胞間層中的木質(zhì)素，導(dǎo)致纖維的分離。目前，國(guó)內(nèi)利用白腐菌的生物降解研究大都處于實(shí)驗(yàn)室階段[21]。</p><p>　　1.3 秸稈預(yù)處理技術(shù)</p><p

38、>　　天然生物質(zhì)的抗性問(wèn)題，是制約纖維質(zhì)乙醇發(fā)展的主要瓶頸問(wèn)題之一，而預(yù)處理技術(shù)是解決這一瓶頸的重要途徑。預(yù)處理工藝的選擇一般要遵循以下幾條：（1）提高可還原性糖的釋放量；（2）避免纖維素的降解和損失；（3）避免副產(chǎn)物的生成，以免影響后續(xù)的酶解和乙醇發(fā)酵；（4）廉價(jià)而有效。常用的秸稈預(yù)處理技術(shù)包括物理預(yù)處理、化學(xué)預(yù)處理、生物預(yù)處理以及聯(lián)合預(yù)處理技術(shù)[8]。</p><p>　　1.3.1 理化預(yù)處理工藝&l

39、t;/p><p>　　常見(jiàn)的物理預(yù)處理方法包括：機(jī)械破碎法、蒸汽爆破、微波處理、高壓水煮法[15]等。機(jī)械粉碎預(yù)處理既是采用粉碎機(jī)等機(jī)械對(duì)木質(zhì)纖維原料進(jìn)行切割、粉碎、研磨，增大纖維素的微表面積，降低結(jié)晶區(qū)的結(jié)晶度，從而更易與纖維素酶接觸，但這類方法不能去除木質(zhì)素。再如蒸汽爆破預(yù)處理是通過(guò)高壓蒸汽加熱原料到150~220℃，作用20min左右，突然降低壓力，產(chǎn)生二次蒸汽，在木質(zhì)纖維原料內(nèi)部產(chǎn)生強(qiáng)機(jī)械力作用，破壞木質(zhì)纖維

40、結(jié)構(gòu)，分解了大部分半纖維素和少部分木素，使得纖維素暴露出來(lái)，更易與纖維素酶作用，但這個(gè)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生可能影響后續(xù)酶解糖化和乙醇發(fā)酵的醛類和酸類副產(chǎn)物。</p><p>　　常見(jiàn)的化學(xué)預(yù)處理方法包括堿處理，酸處理，有機(jī)溶劑預(yù)處理，臭氧預(yù)處理[16]等。通過(guò)堿液可以破壞木質(zhì)素結(jié)構(gòu)，使其變成容易溶解的羥基木質(zhì)素，在基本不損失半纖維素和纖維素的前提下去除木質(zhì)素。而高溫酸預(yù)處理則是通過(guò)破壞纖維素的結(jié)晶區(qū)結(jié)構(gòu)和水解半纖維素，使

41、木質(zhì)纖維原料變得更加疏松，更容易得到充分利用。</p><p>　　1.3.2 生物預(yù)處理工藝</p><p>　　物理預(yù)處理工藝的過(guò)程方法較為簡(jiǎn)單，對(duì)環(huán)境污染較小，但能耗較高，成本較高?；瘜W(xué)預(yù)處理能耗較小、效率較高。但對(duì)設(shè)備的要求高，殘留的化學(xué)試劑需要處理，且易造成污染。但是生物預(yù)處理工藝是節(jié)能減排的環(huán)境友好型的預(yù)處理工藝，其能耗也低。</p><p>　　生物方

42、法脫木質(zhì)素有成本低、污染輕的優(yōu)點(diǎn),已成為國(guó)際開(kāi)發(fā)利用纖維資源的熱門課題,近年來(lái),人們對(duì)高效木質(zhì)素降解菌的篩選和分離做了大量的工作。白腐菌是目前研究得最為廣泛的木質(zhì)素降解菌種,研究表明,白腐菌是降解木質(zhì)素類芳香化合物能力最強(qiáng)的微生物[18]。</p><p>　　1.3.3 秸稈白腐菌預(yù)處理存在的問(wèn)題</p><p>　　雖然生物預(yù)處理是環(huán)境友好型且低能耗的預(yù)處理技術(shù)，但是目前還是存在著很多

43、問(wèn)題，處理周期長(zhǎng)是第一大問(wèn)題。除此之外，還有生物預(yù)處理需要在生物反應(yīng)器中進(jìn)行，其接種制種成本也較高。和理化預(yù)處理相比，其最大的問(wèn)題便是糖轉(zhuǎn)化率較低。所以，如何提高其糖轉(zhuǎn)化率變成了目前大家比較關(guān)注的問(wèn)題。</p><p>　　1.3.4 纖維質(zhì)乙醇的研究及其存在的技術(shù)屏障</p><p>　　在石油、煤炭等化石能源日益枯竭的今天，乙醇作為一種可以直接添加在汽油中的可再生清潔燃料，已成為新能源

44、的發(fā)展重點(diǎn)。目前，我國(guó)是世界上繼巴西、美國(guó)之后第三大燃料乙醇生產(chǎn)國(guó)。</p><p>　　木質(zhì)纖維素作為一種分布廣泛、產(chǎn)量巨大的可再生資源，其中所富含的纖維素和半纖維素等多糖類物質(zhì)可以在纖維素酶和酵母的作用下水解為單糖繼而轉(zhuǎn)化為乙醇即纖維質(zhì)乙醇。木質(zhì)纖維素是植物細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)框架，其來(lái)源包括木材、草類、農(nóng)業(yè)殘?jiān)⑸謴U棄物等，是地球上最豐富的生物質(zhì)之一。因此，利用木質(zhì)纖維素資源生產(chǎn)纖維質(zhì)乙醇逐漸成為當(dāng)前乙醇產(chǎn)業(yè)

45、發(fā)展的主要方向。</p><p>　　生物質(zhì)轉(zhuǎn)化乙醇主要是利用的纖維素產(chǎn)生的還原糖，再用酵母發(fā)酵得到乙醇，而木質(zhì)纖維素對(duì)生物轉(zhuǎn)化的高抗性導(dǎo)致高昂的生產(chǎn)成本，使其規(guī)?；a(chǎn)受到限制。在木質(zhì)纖維素中，木質(zhì)素是限制酶解的最為重要的抗性因子，其在酶解中的作用尤其值得關(guān)注[14]。所以，其預(yù)處理難點(diǎn)在于怎樣提高木質(zhì)素的降解而降低纖維素的降解，進(jìn)而提高木質(zhì)纖維素的轉(zhuǎn)化效率、實(shí)現(xiàn)纖維質(zhì)乙醇的商業(yè)化生產(chǎn)。</p>

46、<p>　　1.4 課題思路的提出與設(shè)計(jì)</p><p>　　纖維乙醇作為一種可再生的替代能源，越來(lái)越受到重視，纖維素預(yù)處理技術(shù)對(duì)纖維素資源的利用及乙醇生產(chǎn)成本的控制起著重要作用。與物理方法和化學(xué)方法相比，生物預(yù)處理可實(shí)現(xiàn)溫和條件下有效減弱生物質(zhì)抗性、提高生物質(zhì)轉(zhuǎn)化效率。而白腐菌是目前已知的降解木質(zhì)素最強(qiáng)的微生物，所以白腐菌預(yù)處理秸稈優(yōu)化條件的篩選就顯得尤為重要。鑒于此，本次畢業(yè)設(shè)計(jì)將通過(guò)多因子優(yōu)化的實(shí)

47、驗(yàn)篩選出開(kāi)放條件下白腐菌預(yù)處理秸稈培養(yǎng)的目標(biāo)因子。</p><p>　　1.4.1 課題設(shè)計(jì)路線</p><p>　　圖1-1 課題設(shè)計(jì)路線圖</p><p>　　1.4.2 因子的選擇</p><p>　　由于溫度、氧氣、濕度是影響白腐菌生長(zhǎng)的基本生長(zhǎng)條件，麩皮、酵母、Cu2+、Fe2+、K+、Mn2+、Zn2+、Ca2+和Mg2+是影響白

48、腐菌營(yíng)養(yǎng)供給的基本因子，可知這些因子和指標(biāo)對(duì)白腐菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和新陳代謝具有重要影響。</p><p>　　因此，根據(jù)對(duì)白腐菌生長(zhǎng)和其降解木質(zhì)素的酶的影響，結(jié)合前期研究成果及他人研究結(jié)論，選取了溫度、氧氣、濕度、麩皮、酵母、Cu2+、Fe2+、K+、Mn2+、Zn2+、Ca2+和Mg2+作為供選因子。通過(guò)測(cè)定糖化率、酶活以及不同條件處理后秸稈的組分進(jìn)行分析比較以篩選出最優(yōu)的條件。</p><p&

49、gt;　　2 白腐菌預(yù)處理秸稈溫度與通氧的優(yōu)化</p><p><b>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p><b>　　2.1.1 菌株</b></p><p>　　Irpex lacteus CD2，乳白耙菌，采集、分離自神農(nóng)架。其種屬是通過(guò)對(duì)該真菌rRNA上的序列ITS(Internal Transcribe

50、d Spacer)擴(kuò)增測(cè)序，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源比對(duì)分析來(lái)確定的。</p><p>　　2.1.2 纖維素酶</p><p>　　無(wú)錫雪酶，來(lái)源于無(wú)錫市雪梅酶制劑科技有限公司。具有纖維素和半纖維素活性，總纖維素酶活(FPU)為30FPU/g。</p><p>　　2.1.3 主要藥品與試劑</p><p>　?。?）3,5-二硝基水楊酸

51、試劑(DNS)：182g酒石酸鉀鈉溶于500mL熱水中，先加入3,5-二硝基水楊酸6.3g與2M氫氧化鈉溶液262mL，最后再加重結(jié)晶酚5g和NaHSO3 5g攪拌溶解，冷卻后定容到1000mL，貯于棕色瓶中，一周后可用。</p><p>　?。?）pH4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液：100mL0.2M的醋酸與150mL0.2M的醋酸鈉混合后，定容到1000mL。</p><p>　?。?）纖

52、維素酶液：取10g纖維素粗酶于1000mLpH4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液，用玻璃棒攪拌均勻后置于50℃水浴鍋中每隔半小時(shí)攪拌一次，5小時(shí)后取出放冰箱中過(guò)夜。第二天用真空泵隔三層濾紙抽濾后，取抽濾液和緩沖液按1:1混合。再按千分之一的量加疊氮化鈉。</p><p>　　2.1.4 生物質(zhì)來(lái)源與準(zhǔn)備</p><p>　　玉米秸稈來(lái)源于湖北麻城采集后曬干、粉碎，保存于干燥通風(fēng)處；使用之前分別用2

53、0目和60目篩網(wǎng)分級(jí)，收集粒度介于20目～60目之間的粉末用于后續(xù)研究。</p><p><b>　　2.1.5 培養(yǎng)基</b></p><p>　?。?）菌株活化培養(yǎng)基：PDA(Potato Dextrose Agar)培養(yǎng)基(g/L)，土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，pH自然。</p><p>　?。?）秸稈平板培養(yǎng)基：17g秸稈與

54、3g麩皮與水按固液比1:2.5加水，用手抓勻，平鋪在平板，壓實(shí)。</p><p>　?。?）液體種子培養(yǎng)基：PDB(Potato Dextrose Broth)培養(yǎng)基(g/L)，土豆200g，葡萄糖20g，pH自然。</p><p>　?。?）玉米秸稈固體接種體：按照玉米秸稈:水＝1:2.5 的比例配制，每只250mL的三角瓶裝2g，報(bào)紙和塑料膜包扎，121℃滅菌30min備用。</

55、p><p><b>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　2.2.1 菌株的活化與制備</p><p>　?。?）菌株活化：取出保存的PDA菌種，挑出一塊置于平板上，28℃培養(yǎng)3~4d，備用。</p><p>　?。?）液體種子制備：用滅菌后的接種針挑取2~3小塊活化的菌種，置于PDB培養(yǎng)基中，28℃下，150r

56、/min搖床培養(yǎng)6d，備用。</p><p>　　2.2.2 白腐菌預(yù)處理秸稈的不同溫度與通氧條件</p><p>　　將制好的液體種子吸去PDB上清液，用無(wú)菌接種管吸取2mL菌球均勻的灑在已準(zhǔn)備好的玉米秸稈固體接種體培養(yǎng)基上。將三角瓶封口，分別于28℃，32℃，37℃環(huán)境下培養(yǎng)。每個(gè)溫度放置6瓶。氧氣的培養(yǎng)瓶（磨口瓶，連有磨口三通管，用封口膜封閉）放在28℃環(huán)境下，每三天通氧一次，每次1

57、0min。</p><p>　　2.2.3 取樣時(shí)間與方法</p><p>　　分別于培養(yǎng)后的2，4，6周取出樣品進(jìn)行烘干酶解糖化及后續(xù)試驗(yàn)，每個(gè)樣品做兩個(gè)平行。</p><p>　　2.2.4 生物質(zhì)酶解糖化</p><p>　　白腐菌處理后的秸稈于60℃烘箱烘72h，稱取并計(jì)算其質(zhì)量損失。用兩種方法對(duì)其進(jìn)行酶解。</p>&

58、lt;p>　　（1）取0.160g預(yù)處理后烘干的秸稈粉末，加入制好的纖維素酶液8mL，使固液比例達(dá)到1:50，于50℃酶解72h，轉(zhuǎn)速100r/min。酶解后用定性濾紙過(guò)濾，棄濾渣，濾液用于測(cè)定還原糖含量。</p><p>　?。?）按0.160g乘以相應(yīng)樣品的質(zhì)量損失稱取秸稈粉末，加入制好的纖維素酶液 8mL，使固液比例達(dá)到1:50，于50℃酶解72h，轉(zhuǎn)速100r/min。酶解后用定性濾紙過(guò)濾，棄濾渣，

59、濾液用于測(cè)定還原糖含量。</p><p>　　轉(zhuǎn)化率（Transformation Rate，TR）反映了單位質(zhì)量生物質(zhì)酶解釋放可發(fā)酵糖的能力，因此用轉(zhuǎn)化率變化表示不同條件下菌株對(duì)生物質(zhì)的改性程度。以酶解轉(zhuǎn)化得到的還原糖質(zhì)量占酶解前生物質(zhì)質(zhì)量百分比表示各樣品轉(zhuǎn)化率，公式為：</p><p><b>　?。?.1）</b></p><p>　　糖

60、化率（Saccharification Rate，SR）為各條件下菌株處理后生物質(zhì)糖化的還原糖量占菌株處理前生物質(zhì)中能源底物的比例，能源底物指能被轉(zhuǎn)化為單糖的綜纖維素（纖維素和半纖維素）。糖化率的計(jì)算與定義考慮了各菌株預(yù)處理造成的生物質(zhì)質(zhì)量損失，公式為：</p><p>　?。?.2）2.2.5 還原糖測(cè)定方法</p><p>　　DNS法(二硝基水楊酸法) [22]：堿性條件下二硝基水楊

61、酸（DNS）與還原糖發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成3-氨基-5-硝基水楊酸，該產(chǎn)物在煮沸條件下顯棕紅色，且在一定濃度范圍內(nèi)顏色深淺與還原糖含量成比例關(guān)系，可用比色法測(cè)定。因其顯色的深淺只與糖類游離出還原基團(tuán)的數(shù)量有關(guān)，而對(duì)還原糖的種類沒(méi)有選擇性，故DNS方法適合用在多糖（如纖維素、半纖維素和淀粉等）水解產(chǎn)生的多種還原糖體系中。</p><p>　　取1.5mL適當(dāng)稀釋的待測(cè)液，加入2mLDNS，沸水浴反應(yīng)10min后迅速

62、流水冷卻以終止反應(yīng)，于540nm測(cè)定吸光值，根據(jù)樣品吸光值及葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中還原糖含量。同時(shí)設(shè)1.5mL蒸餾水與2mLDNS的空白對(duì)照。以葡萄糖為參照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：取11支螺口具塞試管，分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.5mg/mL），用蒸餾水補(bǔ)足至1.5mL，加入2mLDNS，沸水浴反應(yīng)10min后迅速流水冷卻以終止反應(yīng)，于540nm測(cè)定吸光值。以

63、吸光值為橫坐標(biāo)、葡萄糖濃度為縱坐標(biāo)制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖2-1，圖2-2，圖2-3）。</p><p>　　圖2-1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線1（計(jì)質(zhì)量損失）</p><p>　　圖2-2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線2（計(jì)質(zhì)量損失）</p><p>　　圖2-3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線3（不計(jì)質(zhì)量損失）</p><p>　　2.2.6 木質(zhì)素含量測(cè)定</p>

64、<p>　　參考Goering法（格林法）和 Van Soest 法（凡氏法）[23]測(cè)定固體生物質(zhì)樣品中纖維素與半纖維素含量，纖維素為72%硫酸消化的部分，半纖維素為中性洗滌纖維NDF與酸性洗滌纖維ADF含量之差；參考美國(guó)可再生能源實(shí)驗(yàn)室（NREL）方法[24]測(cè)定酸不溶木質(zhì)素（Acid Insoluble Lignin，AIL）、酸溶木質(zhì)素（Acid Soluble Lignin，ASL）及酸不溶灰分含量，木質(zhì)素含量為

65、AIL與ASL之和。（受時(shí)間限制，木質(zhì)纖維素含量暫未測(cè)定。）</p><p>　　2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析</p><p>　　對(duì)每個(gè)樣品測(cè)其還原糖，結(jié)果如下（圖2-4，圖2-5）：</p><p>　　注：不計(jì)算質(zhì)量損失可得糖化率，以處理前后的樣品質(zhì)量為標(biāo)準(zhǔn)得到。</p><p>　　圖2-4 氧氣溫度因素處理秸稈不同時(shí)間內(nèi)酶解所得還原糖含量

66、（不計(jì)質(zhì)量損失）</p><p>　　圖2-4顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，每克秸稈所得的還原糖的量逐漸增加，但第2周-第4周增長(zhǎng)的速率明顯大于第4周-第6周，所以結(jié)合培養(yǎng)時(shí)間和增長(zhǎng)速率綜合考慮，培養(yǎng)4周是較理想的培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)。圖2-4還可表明，氧氣的添加是可以明顯促進(jìn)白腐菌預(yù)處理秸稈所得的還原糖的量的因素，故通氧是比較可行的提高白腐菌預(yù)處理秸稈所得還原糖量的方式。</p><p>　　注：計(jì)算質(zhì)

67、量損失可得絕對(duì)糖化率，以處理前后的樣品質(zhì)量為標(biāo)準(zhǔn)得到。</p><p>　　圖2-5 氧氣溫度因素處理秸稈不同時(shí)間內(nèi)酶解所得還原糖含量（計(jì)質(zhì)量損失）</p><p>　　由圖2-5可看出，當(dāng)考慮質(zhì)量損失時(shí)，雖然總的還原糖的變化趨勢(shì)沒(méi)有改變，但是其轉(zhuǎn)化率以及還原糖的量是有變化的。所以后續(xù)試驗(yàn)可以通過(guò)組分的測(cè)定來(lái)明確質(zhì)量損失的是哪種具體的成分，以期發(fā)現(xiàn)白腐菌對(duì)秸稈木質(zhì)纖維素各組分的利用情況。&

68、lt;/p><p>　　綜上所述，通過(guò)對(duì)不同溫度和氧氣處理下白腐菌預(yù)處理秸稈的效果可得28℃下培養(yǎng)4周為白腐菌預(yù)處理秸稈的最優(yōu)條件，在此條件下處理后玉米秸稈的還原糖的量可達(dá)321.8726mg/g。而在該條件下通氧處理后玉米秸稈的還原糖的量可達(dá)335.4663mg/g。所以該部分試驗(yàn)篩選出兩個(gè)影響因素分別為溫度28℃和通氧，同時(shí)確定了最佳取樣時(shí)長(zhǎng)為4周。</p><p>　　3 白腐菌預(yù)處理秸

69、稈多因子的進(jìn)一步優(yōu)化</p><p><b>　　3.1 實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p><b>　　3.1.1 菌株</b></p><p>　　Irpex lacteus CD2，乳白耙菌，采集、分離自神農(nóng)架。其種屬是通過(guò)對(duì)該真菌rRNA上的序列ITS(Internal Transcribed Spacer)擴(kuò)增測(cè)序

70、，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源比對(duì)分析來(lái)確定的。</p><p>　　3.1.2 纖維素酶</p><p>　　無(wú)錫雪酶，來(lái)源于無(wú)錫市雪梅酶制劑科技有限公司。具有纖維素和半纖維素活性，總纖維素酶活(FPU)為30FPU/g。</p><p>　　3.1.3 主要藥品與試劑</p><p>　　(1)3,5-二硝基水楊酸試劑(DNS)：182g酒

71、石酸鉀鈉溶于500mL熱水中，先加入3，5-二硝基水楊酸6.3g與2M氫氧化鈉溶液262mL，最后再加重結(jié)晶酚5g和NaHSO3 5g攪拌溶解，冷卻后定容到1000mL，貯于棕色瓶中，一周后可用。</p><p>　　（2）pH4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液：100mL0.2M的醋酸與150mL0.2M的醋酸鈉混合后，定容到1000mL。</p><p>　　（3）纖維素酶液：取10g纖維素粗

72、酶于1000mL pH4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液，用玻璃棒攪拌均勻后置于50℃水浴鍋中每隔半小時(shí)攪拌一次，5小時(shí)后取出放冰箱中過(guò)夜。第二天用真空泵隔三層濾紙抽濾后，取抽濾液和緩沖液按1:1混合。再按千分之一的量加疊氮化鈉。</p><p>　　3.1.4 生物質(zhì)來(lái)源與準(zhǔn)備</p><p>　　玉米秸稈來(lái)源于湖北麻城采集后曬干、粉碎，保存于干燥通風(fēng)處；使用之前分別用20目和60目篩網(wǎng)分級(jí)，收

73、集粒度介于20目～60目之間的粉末用于后續(xù)研究。</p><p><b>　　3.1.5 培養(yǎng)基</b></p><p>　?。?）菌株活化培養(yǎng)基（秸稈平板）：PDA(Potato Dextrose Agar)培養(yǎng)基(g/L)，土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，pH自然。</p><p>　　（2）液體種子培養(yǎng)基：PDB(Potato D

74、extrose Broth)培養(yǎng)基(g/L)，土豆200g，葡萄糖20g，pH自然。</p><p>　　（3）白腐菌預(yù)處理秸稈的各優(yōu)化培養(yǎng)基（見(jiàn)表3-1）：</p><p>　　表3-1 不同因子條件下處理的培養(yǎng)基</p><p><b>　　3.2 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　3.2.1 菌株的活化與制備&

75、lt;/p><p>　　（1）菌株活化：取出保存的PDA菌種，挑出一塊置于平板上，28℃培養(yǎng)3~4d，備用。</p><p>　?。?）液體種子制備：用滅菌后的接種針挑取2~3小塊活化的菌種，置于PDB培養(yǎng)基中，28℃下，150r/min搖床培養(yǎng)6d，備用。</p><p>　　3.2.2 白腐菌預(yù)處理秸稈不同因子的培養(yǎng)基處理</p><p>　

76、　將制好的液體種子吸去PDB上清液，用無(wú)菌接種管吸取2mL菌球均勻的灑在已準(zhǔn)備好的玉米秸稈固體接種體培養(yǎng)基上。將三角瓶封口，置于28℃環(huán)境下培養(yǎng)。</p><p>　　3.2.3 取樣時(shí)間與方法</p><p>　　于培養(yǎng)后的4周取出樣品進(jìn)行烘干酶解糖化及后續(xù)試驗(yàn)，每個(gè)樣品做兩個(gè)平行。</p><p>　　3.2.4 生物質(zhì)酶解糖化</p><p

77、>　　白腐菌處理后的秸稈于60℃烘箱烘72h，稱取并計(jì)算其質(zhì)量損失。用兩種方法對(duì)其進(jìn)行酶解。</p><p>　?。?）取0.160g預(yù)處理后烘干的秸稈粉末，加入制好的纖維素酶液8mL，使固液比例達(dá)到1:50，于50℃酶解72h，轉(zhuǎn)速100r/min。酶解后用定性濾紙過(guò)濾，棄濾渣，濾液用于測(cè)定還原糖含量。</p><p>　?。?）按0.160g乘以相應(yīng)樣品的質(zhì)量損失稱取秸稈粉末，加

78、入制好的纖維素酶液 8mL，使固液比例達(dá)到1:50，于50℃酶解72h，轉(zhuǎn)速100r/min。酶解后用定性濾紙過(guò)濾，棄濾渣，濾液用于測(cè)定還原糖含量。</p><p>　　轉(zhuǎn)化率（Transformation Rate，TR）反映了單位質(zhì)量生物質(zhì)酶解釋放可發(fā)酵糖的能力，因此用轉(zhuǎn)化率變化表示不同條件下菌株對(duì)生物質(zhì)的改性程度。以酶解轉(zhuǎn)化得到的還原糖質(zhì)量占酶解前生物質(zhì)質(zhì)量百分比表示各樣品轉(zhuǎn)化率，公式為：</p>

79、;<p><b>　　（3.1）</b></p><p>　　糖化率（Saccharification Rate，SR）為各條件下菌株處理后生物質(zhì)糖化的還原糖量占菌株處理前生物質(zhì)中能源底物的比例，能源底物指能被轉(zhuǎn)化為單糖的綜纖維素（纖維素和半纖維素）。糖化率的計(jì)算與定義考慮了各菌株預(yù)處理造成的生物質(zhì)質(zhì)量損失，公式為：</p><p>　?。?.2）3.2

80、.5 還原糖測(cè)定方法</p><p>　　DNS法[22]，具體方法為：取1.5mL適當(dāng)稀釋的待測(cè)液，加入2mL DNS，沸水浴反應(yīng)10min后迅速流水冷卻以終止反應(yīng)，于540nm測(cè)定吸光值，根據(jù)樣品吸光值及葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中還原糖含量。同時(shí)設(shè)1.5mL蒸餾水與2mL DNS的空白對(duì)照。以葡萄糖為參照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：取11支螺口具塞試管，分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.

81、8、0.9、1.0mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.5mg/mL），用蒸餾水補(bǔ)足至1.5mL，加入2mL DNS，沸水浴反應(yīng)10min后迅速流水冷卻以終止反應(yīng)，于540nm測(cè)定吸光值。以吸光值為橫坐標(biāo)、葡萄糖濃度為縱坐標(biāo)制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖3-1，圖3-2，圖3-3）。</p><p>　　圖3-1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線1（計(jì)質(zhì)量損失）</p><p>　　圖3-2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線2（計(jì)質(zhì)量損失）&l

82、t;/p><p>　　圖3-3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線3（不計(jì)質(zhì)量損失)</p><p>　　3.2.6 木質(zhì)素含量測(cè)定</p><p>　　參考Goering和 Van Soest 法[23]測(cè)定固體生物質(zhì)樣品中纖維素與半纖維素含量，纖維素為72%硫酸消化的部分，半纖維素為中性洗滌纖維NDF與酸性洗滌纖維ADF含量之差；參考美國(guó)可再生能源實(shí)驗(yàn)室（NREL）方法[24]測(cè)定酸不

83、溶木質(zhì)素（Acid Insoluble Lignin，AIL）、酸溶木質(zhì)素（Acid Soluble Lignin，ASL）及酸不溶灰分含量，木質(zhì)素含量為AIL與ASL之和。</p><p>　　3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析</p><p>　　對(duì)每個(gè)樣品測(cè)其還原糖，計(jì)算后結(jié)果如下（圖3-4，圖3-5）：</p><p>　　注：理論上的質(zhì)量損失是培養(yǎng)前后大部分木質(zhì)素被降

84、解的質(zhì)量以及少部分纖維素被降解的質(zhì)量，一般情況下為20%左右，15%到25%都屬于正常范圍。</p><p>　　圖3-4 不同影響因素作用相同時(shí)間酶解產(chǎn)糖分析（不計(jì)質(zhì)量損失）</p><p>　　由圖3-4可看出，與空白對(duì)照和原料相比，添加了高濃度K+、Ca2+、Mn2+、Mg2+、Cu2+、酵母、麩皮、高濕度和低濃度K+、Ca2+、Mn2+、Mg2+、Cu2+、酵母、麩皮、低濕度的培養(yǎng)

85、條件下，低濃度Mn2+，高濕度的秸稈培養(yǎng)基可以明顯提高白腐菌預(yù)處理秸稈產(chǎn)還原糖的量，還原糖產(chǎn)量分別可達(dá)369.1037mg/g、312.2477mg/g。</p><p>　　注：理論上的質(zhì)量損失是培養(yǎng)前后大部分木質(zhì)素被降解的質(zhì)量以及少部分纖維素被降解的質(zhì)量，一般情況下為20%左右，15%到25%都屬于正常范圍。</p><p>　　圖3-5 不同影響因素作用相同時(shí)間酶解產(chǎn)糖分析(計(jì)質(zhì)量損

86、失)</p><p>　　圖3-5表明，當(dāng)考慮質(zhì)量損失時(shí)，雖然總的還原糖的變化趨勢(shì)沒(méi)有改變，但是其轉(zhuǎn)化率以及還原糖的量是有變化的。所以后續(xù)試驗(yàn)可以通過(guò)組分的測(cè)定來(lái)明確質(zhì)量損失的是哪種具體的成分，以期發(fā)現(xiàn)白腐菌對(duì)秸稈木質(zhì)纖維素各組分的利用情況。</p><p>　　綜上所述，本節(jié)試驗(yàn)得到的兩個(gè)可以明顯提高白腐菌預(yù)處理秸稈還原糖得率的優(yōu)化因子為低濃度Mn2+離子和高濕度，此時(shí)還原糖的量分別達(dá)到

87、369.1037mg/g、312.2477mg/g。即低濃度Mn2+離子和高濕度是本節(jié)試驗(yàn)篩選出的優(yōu)化因子。 </p><p><b>　　結(jié) 論</b></p><p>　　通過(guò)對(duì)不同溫度和是否通氧處理下白腐菌預(yù)處理秸稈的結(jié)果分析可知，在28℃下培養(yǎng)4周未通氧的條件下處理的玉米秸稈的還原糖的量可達(dá)321.8726mg/g，在28℃下培養(yǎng)4周通氧條件處理后玉米秸稈的還

88、原糖的量可達(dá)335.4663mg/g。所以該部分試驗(yàn)篩選出的兩個(gè)影響因素分別是溫度28℃和通氧，同時(shí)確定了最佳培養(yǎng)時(shí)間為4周。通過(guò)后續(xù)試驗(yàn)得到低濃度的Mn2+離子和高濕度這兩個(gè)可以明顯提高白腐菌預(yù)處理秸稈的還原糖得率的優(yōu)化因子，此時(shí)的還原糖的量分別可達(dá)369.1037mg/g、312.2477 mg/g，即低濃度Mn2+離子和高濕度是本節(jié)試驗(yàn)篩選出的優(yōu)化因子。故本畢業(yè)設(shè)計(jì)得到的可以提高白腐菌預(yù)處理秸稈產(chǎn)還原糖的5個(gè)優(yōu)化因子分別是：（1）

89、28℃溫度條件下培養(yǎng)；（2）培養(yǎng)時(shí)間為4周；（3）通氧；（4）添加低濃度Mn2+離子；（5）提高培養(yǎng)基的濕度。</p><p>　　本次畢業(yè)設(shè)計(jì)發(fā)現(xiàn)經(jīng)白腐菌預(yù)處理秸稈后有一定的質(zhì)量損失，且質(zhì)量損失影響轉(zhuǎn)化率，理論上的質(zhì)量損失是培養(yǎng)前后大部分木質(zhì)素被降解的質(zhì)量以及少部分纖維素被降解的質(zhì)量，一般情況下為20%左右，15%到25%都屬于正常范圍。不計(jì)算質(zhì)量損失可得出糖化率，計(jì)算質(zhì)量損失可得出絕對(duì)糖化率，分別以處理前后的

90、樣品質(zhì)量為標(biāo)準(zhǔn)得到。因本次畢業(yè)設(shè)計(jì)時(shí)間有限所以還有很多后續(xù)試驗(yàn)需要完善，因子的濃度也只設(shè)計(jì)了高低之分，后續(xù)可以在已篩選出的低濃度Mn2+離子和高濕度的基礎(chǔ)上，選擇較多的梯度。本次畢業(yè)設(shè)計(jì)只是發(fā)現(xiàn)了質(zhì)量損失的存在，尚不清晰質(zhì)量損失的是秸稈的具體哪種組分，后續(xù)可以對(duì)秸稈組分進(jìn)行分析，以期能找到高降解木質(zhì)素和低降解纖維素的白腐菌預(yù)處理秸稈的最優(yōu)條件。</p><p><b>　　致 謝</b>&l

91、t;/p><p>　　時(shí)光荏苒，光陰如梭，回想起大一時(shí)初進(jìn)實(shí)驗(yàn)室時(shí)的青澀和無(wú)知，仿佛就在昨天。在近四年的時(shí)間里，我們不僅學(xué)會(huì)了很多實(shí)驗(yàn)技巧和思想方法，而且學(xué)到了很多有關(guān)人生的哲理。</p><p>　　在這里，首先要感謝指導(dǎo)我們畢業(yè)設(shè)計(jì)的黃慧艷老師、余洪波老師，感謝他們辛勤的工作和對(duì)我們的悉心教誨，是黃老師給了我們走進(jìn)華科實(shí)驗(yàn)室的機(jī)會(huì)，也是她一直默默支持著我們所選擇的路。黃老師經(jīng)常在百忙之中抽

92、出時(shí)間和我們討論實(shí)驗(yàn)的問(wèn)題，尤其是這次做畢業(yè)設(shè)計(jì)時(shí)，當(dāng)我們提出關(guān)于實(shí)驗(yàn)進(jìn)展出現(xiàn)的問(wèn)題時(shí)，她在百忙之中一一解答了我們的困惑，不僅如此，還時(shí)常和我們交流實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)，平時(shí)一直很關(guān)心實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程，經(jīng)常抽出時(shí)間指導(dǎo)我們。</p><p>　　繼而要感謝的是陳慶同學(xué)和郭俊成同學(xué)，從我進(jìn)實(shí)驗(yàn)室時(shí)就是他們?cè)谥笇?dǎo)我做實(shí)驗(yàn)，他們不僅教會(huì)了我很多有關(guān)實(shí)驗(yàn)的東西，而且平時(shí)還經(jīng)常和我談心，在我躊躇的時(shí)候給我很多建設(shè)性的意見(jiàn)。</p&g

93、t;<p>　　同時(shí)也要感謝實(shí)驗(yàn)室馬老師，鄔老師及田老師，感謝實(shí)驗(yàn)室里的其他師兄師姐們對(duì)我們實(shí)驗(yàn)技能、實(shí)驗(yàn)方案的悉心指導(dǎo)和熱情關(guān)懷，沒(méi)有他們的幫助，此次畢業(yè)設(shè)計(jì)也是無(wú)法完成的，故再次謹(jǐn)向他們表示我最誠(chéng)摯的感謝！</p><p>　　當(dāng)然，還要感謝我的父母，是父母的默默支持和鼓勵(lì)讓我一直走著自己喜歡的路，是父母的辛勤哺育和諄諄教導(dǎo)成就了我的今天。</p><p>　　最后，感謝

94、所有幫助過(guò)我的朋友們，我堅(jiān)信，有了你們的支持，以后的路我將走得更好！</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 陳洪章.纖維素生物技術(shù).北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.</p><p>　　[2] Betts WB, Dart RK, Ball AS, et al. Biosynthesis and struct

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