彭玲碩士畢業(yè)論文

1、<p>　單位代碼10475</p><p>　學(xué)號(hào)104753081328</p><p>　分類號(hào)Q93</p><p>　碩士學(xué)位論文</p><p>　植物內(nèi)生生防蠟樣芽孢桿菌0-9菌株轉(zhuǎn)座子插入突變體庫的建立及評(píng)價(jià)</p><p>　學(xué)科、專業(yè)：微生物學(xué)</p><p>　研

2、究方向：微生物遺傳與基因工程</p><p>　申請(qǐng)學(xué)位類別：理學(xué)碩士</p><p>　申請(qǐng)人：彭玲</p><p>　指導(dǎo)教師：王剛 副教授</p><p>　二〇一一 年 五 月</p><p>　　關(guān)于學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)聲明和學(xué)術(shù)誠信承諾</p><p>　　本人向河南大學(xué)提出碩士學(xué)位申請(qǐng)

3、。本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下獨(dú)立完成的，對(duì)所研究的課題有新的見解。據(jù)我所知，除文中特別加以說明、標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包括其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包括其他人為獲得任何教育、科研機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同事對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。</p><p>　　在此本人鄭重承諾：所呈交的學(xué)位論文不存在舞弊作偽行為，文責(zé)自負(fù)

4、。</p><p>　　學(xué)位申請(qǐng)人（學(xué)位論文作者）簽名： </p><p>　　201 年 月 日</p><p>　　關(guān)于學(xué)位論文著作權(quán)使用授權(quán)書</p><p>　　本人經(jīng)河南大學(xué)審核批準(zhǔn)授予碩士學(xué)位。作為學(xué)位論文的作者，本人完全了解并同意河南大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的要求，即河南大學(xué)有權(quán)向國

5、家圖書館、科研信息機(jī)構(gòu)、數(shù)據(jù)收集機(jī)構(gòu)和本校圖書館等提供學(xué)位論文（紙質(zhì)文本和電子文本）以供公眾檢索、查閱。本人授權(quán)河南大學(xué)出于宣揚(yáng)、展覽學(xué)校學(xué)術(shù)發(fā)展和進(jìn)行學(xué)術(shù)交流等目的，可以采取影印、縮印、掃描和拷貝等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文（紙質(zhì)文本和電子文本）。</p><p>　?。ㄉ婕氨Ｃ軆?nèi)容的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書）</p><p>　　學(xué)位獲得者（學(xué)位論文作者）簽名：

6、 </p><p>　　201 年 月 日</p><p>　　學(xué)位論文指導(dǎo)教師簽名： </p><p>　　201 年 月 日</p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　生物防治是一種環(huán)境友好型的植物病

7、害綜合治理方法，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有重要的應(yīng)用價(jià)值。目前，對(duì)于利用微生物進(jìn)行生物防治的研究中，不再局限于被動(dòng)地從自然界中尋找生防菌株，而是通過建立生防菌株的突變體庫，篩選生物防治相關(guān)功能基因缺失突變株，利用分子生物學(xué)技術(shù)研究該功能基因，進(jìn)而揭示生防菌生防機(jī)制。</p><p>　　植物內(nèi)生生防細(xì)菌0-9是一株從小麥根部分離獲得的內(nèi)生蠟樣芽孢桿菌，具有生物薄膜形成能力，能穩(wěn)定有效的防治小麥紋枯病，而且能在小麥根際穩(wěn)定定

8、殖。為了全面解釋0-9的生防機(jī)制，本研究利用轉(zhuǎn)座子TnYLB-1，構(gòu)建了野生菌株0-9的轉(zhuǎn)座插入突變體庫。</p><p>　　通過測(cè)定生防菌0-9的生長曲線，探索菌體培養(yǎng)條件，選取0-9對(duì)數(shù)生長期中期的菌體制備原生質(zhì)體；并通過比較不同的破解細(xì)胞壁的反應(yīng)條件，最終確定制備原生質(zhì)體的破壁條件為：溶菌酶終濃度0.25 mg/mL，42 ℃反應(yīng)45 min；在成功獲得0-9的原生質(zhì)體后，通過電擊轉(zhuǎn)化方法，在電阻400

9、Ω，電容5 µF，1.0 kv電擊參數(shù)條件下，成功完成了質(zhì)粒pMarB（攜帶轉(zhuǎn)座子TnYLB-1）對(duì)生防菌株0-9的轉(zhuǎn)化。</p><p>　　根據(jù)質(zhì)粒pMarB上復(fù)制子repG+ts的溫敏特性，利用高溫誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座技術(shù)使轉(zhuǎn)座子TnYLB-1轉(zhuǎn)座插入到0-9基因組上，成功構(gòu)建了含有1125株突變株的突變體庫；另外，通過對(duì)不同高溫誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座條件的比較，確認(rèn)最佳轉(zhuǎn)座條件為： 46 ℃處理10 h，在此條件下，轉(zhuǎn)座

10、效率高達(dá)90.38%。</p><p>　　獲得0-9的突變體庫后，通過初步比較突變株與野生菌株0-9菌落形態(tài)特征，從突變體庫中篩選獲得202株菌落形態(tài)突變株；之后從202株突變株中選取菌落形態(tài)特征與野生菌株有明顯差異的5株突變株：539、573、609、629、638，進(jìn)一步通過比較5株突變株和野生菌株0-9菌落形態(tài)特征、運(yùn)動(dòng)能力、小麥根際定殖能力、對(duì)小麥紋枯病生物防治能力以及在非生物表面形成生物薄膜的能力來對(duì)

11、突變體庫進(jìn)行表型評(píng)價(jià)；并利用分子生物學(xué)手段PCR技術(shù)和Southern雜交技術(shù)對(duì)突變體庫進(jìn)行分子水平上的評(píng)價(jià)。</p><p>　　表型評(píng)價(jià)結(jié)果證實(shí)，5株突變株與野生菌株在表型特征上存在著明顯差異；PCR擴(kuò)增結(jié)果說明5株突變株基因組上具有轉(zhuǎn)座子TnYLB-1的同源序列，但在野生菌株0-9基因組上沒有；利用Southern雜交技術(shù)，檢測(cè)到TnYLB-1在突變株539、609、629基因組上具有不相同的插入位點(diǎn)，但是

12、，在突變株573和638基因組上并沒有檢測(cè)到TnYLB-1插入序列。綜合表型評(píng)價(jià)和分子生物學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果，我們初步認(rèn)為所建立的突變體庫是由轉(zhuǎn)座子TnYLB-1隨機(jī)插入到野生菌株0-9基因組上獲得的，可以作為下一步研究野生菌株0-9生防機(jī)制的基礎(chǔ)。</p><p>　　關(guān)鍵詞：生物防治，遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)座插入，突變體庫 </p><p><b>　　ABSTRACT</b>

13、</p><p>　　Biological control plays an important role in agriculture as an environment-friendly method of comprehensive control of plant disease. Nowadays, the study of biological control is no longer confine

14、d to passively separate biocontrol bacteria from nature, but to find the mechanism of biocontrol bacteria by establish mutant libraries. </p><p>　　Bacillus cereus 0-9, isolated from the health wheat root by

15、our laboratory, showed the ability of forming biofilm on non-biological materials and the effective function on controlling the wheat sharp eyespot in the greenhouse; and could colonize the wheat rhizosphere well. </p

16、><p>　　In this study, we measured the growth curve of 0-9, and according to the curve, we choose the cells of 0-9, which is in the mid-logarithmic phase, as the material of making protoplasts. After comparing t

17、he effective of making protoplasts under different conditions, we ultimately chose the following condition: breaking the cells’ wall at 42 ℃ 45min by using lysozyme (0.25 mg/mL), and we got the protoplasts of 0-9 with hi

18、gh regeneration rate.</p><p>　　Then, plasmid pMarB carrying transponson TnYLB-1 was transformed into 0-9 protoplasts by electroporation. According to the transposon TnYLB-1 mediated insertional mutagenesis t

19、echnique, the transposon TnYLB-1 successfully inserted the genome of 0-9 and 1125 mutants were screened that are resistant to kanamycin but erythromycin.</p><p>　　In order to verify integration of TnYLB-1 in

20、to 0-9 chromosome and test whether the insertions are likely to be random, PCR and southern blotting analyses were performed on 5 kanamycin resistant clones that had been named 539,573,609,629,638 and showed obvious diff

21、erence with the wild type. And the PCR amplification results proved the fact that the five kanamycin resistant clones have homologous sequence with transposon TnYLB-1, while the wild strain without; moreover, the result

22、of southern blot</p><p>　　In addition, we compared the phenotypic characters between the 5 kanamycin resistant clones and the wild strain 0-9, such as the ability of forming biofilm, the characteristics of c

23、olony morphology and swimming, the effective of bio-control and the root-colonization ability; as a result, we found that there is obvious discrepancy between them.</p><p>　　In sum, we think that the transpo

24、son TnYLB-1 was successfully inserted on the genome of Bacillus cereus 0-9 with randomness of insertion sites; therefore, we could isolate insertion mutations from the mutant library of 0-9, and research the relative fun

25、ction genes which play important role in preventing plant diseases.</p><p>　　KEY WORDS：biological control,transformation,insertional mutagenesis,mutant library</p><p><b>　　目 錄</b>&l

26、t;/p><p><b>　　摘 要I</b></p><p>　　ABSTRACTIII</p><p><b>　　目 錄VI</b></p><p><b>　　1 引言1</b></p><p>　　1.1 小麥紋枯病的危害以及防治1&l

27、t;/p><p>　　1.1.1 小麥紋枯病對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的影響1</p><p>　　1.1.2 小麥紋枯病的主要防治方法1</p><p>　　1.2 植物病害生物防治2</p><p>　　1.2.1 植物病害生物防治的概念2</p><p>　　1.2.2 植物病害生物防治的發(fā)展前景2</p>

28、<p>　　1.2.3 分子生物學(xué)技術(shù)在研究植物病害生物防治機(jī)制中的應(yīng)用3</p><p>　　1.3 植物內(nèi)生生防細(xì)菌4</p><p>　　1.3.1 植物內(nèi)生細(xì)菌的概念4</p><p>　　1.3.2 植物內(nèi)生芽孢桿菌在生物防治研究中的應(yīng)用5</p><p>　　1.3.3 植物內(nèi)生生防細(xì)菌與其生防能力相關(guān)特性5&

29、lt;/p><p>　　1.4 立題依據(jù)和研究意義7</p><p><b>　　2 材料與方法9</b></p><p>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料9</p><p>　　2.1.1 菌株及質(zhì)粒9</p><p>　　2.1.2 供試小麥9</p><p>　　2.1.3

30、 供試病原真菌10</p><p>　　2.1.4 培養(yǎng)基10</p><p>　　2.1.5 試劑11</p><p>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法12</p><p>　　2.2.1 生防芽孢桿菌0-9原生質(zhì)體電擊轉(zhuǎn)化12</p><p>　　2.2.2 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座，建立突變體庫16</p>&

31、lt;p>　　2.2.3 突變體庫的評(píng)價(jià)17</p><p>　　3 結(jié)果與分析25</p><p>　　3.1 生防芽孢桿菌0-9原生質(zhì)體電擊轉(zhuǎn)化25</p><p>　　3.1.1 質(zhì)粒pMarB電擊轉(zhuǎn)化E.coli GM216325</p><p>　　3.1.2 生防菌0-9生長曲線測(cè)定25</p>&l

32、t;p>　　3.1.3 生防菌0-9原生質(zhì)體的制備以及電擊轉(zhuǎn)化25</p><p>　　3.2 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座子TnYLB-1轉(zhuǎn)座：28</p><p>　　3.3 突變體庫的評(píng)價(jià)：28</p><p>　　3.3.1 表型評(píng)價(jià)：29</p><p>　　3.3.2 從分子水平上評(píng)價(jià)突變體庫：38</p><p&

33、gt;<b>　　4 結(jié)論41</b></p><p><b>　　5 討論45</b></p><p><b>　　6 展望49</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)：51</b></p><p><b>　　版權(quán)聲明55&l

34、t;/b></p><p><b>　　致謝57</b></p><p><b>　　1 引言</b></p><p>　　1.1 小麥紋枯病的危害以及防治</p><p>　　1.1.1 小麥紋枯病對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的影響</p><p>　　由禾谷絲核菌（Rhizocto

35、nia cerealis Vander Hoeven）侵染所引起的小麥紋枯病( wheat- sharp eyesport )是世界范圍危害小麥生長的一種重要土壤傳播病害。小麥幼苗感染紋枯病后，莖基部發(fā)黑，葉鞘枯死，產(chǎn)量嚴(yán)重下降[1]。據(jù)有關(guān)資料顯示[2]，由小麥紋枯病造成的小麥減產(chǎn)輕微時(shí)可達(dá)到5%～10%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)到20 %～40 %，最嚴(yán)重時(shí)顆粒無收。由于小麥?zhǔn)侵饕霓r(nóng)產(chǎn)品之一，其產(chǎn)量關(guān)系著整個(gè)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，更關(guān)系著世界糧食資源

36、問題，因此，有效防治小麥紋枯病的發(fā)生是保證小麥高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的前提條件。</p><p>　　1.1.2 小麥紋枯病的主要防治方法</p><p>　　小麥紋枯病的高發(fā)期是冬前和拔節(jié)期，具有明顯的發(fā)病規(guī)律[3]，我國某些地區(qū)根據(jù)這些規(guī)律及特點(diǎn)，采用傳統(tǒng)的輪作方法以降低小麥紋枯病的危害程度；另外，對(duì)作物抗耐病品種的開發(fā)也成為人們防治作物病害的重要措施。但是，由于小麥紋枯病病原菌通過土壤傳播，且具有

37、廣泛的宿主范圍，因此輪作方法不能有效的抑制病害；而目前在生產(chǎn)中尚缺乏抗病品種[4]，因此，對(duì)小麥紋枯病的防治主要采用田間噴灑化學(xué)農(nóng)藥或者用化學(xué)藥劑如三唑酮（triadimefon）、井岡霉素（validamycin）、戊唑醇（tebuconazole）、咯菌腈（fludioxonil）、丙環(huán)唑（propiconazole）、苯醚甲環(huán)唑（difenoconazole）等[5]拌種以殺死致病真菌，從而有效控制小麥紋枯病的發(fā)生。利用化學(xué)農(nóng)藥防

38、治作物病害，會(huì)在田間殘留大量化學(xué)藥劑，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，破壞自然界的生態(tài)平衡[6]，威脅著人類的生存和發(fā)展；另外，長期使用化學(xué)藥劑，會(huì)導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗逆性強(qiáng)的菌核[7]，不易被藥劑殺死，從而達(dá)不到很好的防治效果，反而增大防治難度。因此，人們開始尋找一種高效、環(huán)保、安全的防治措施。自Weller（1988）成功地</p><p>　　1.2 植物病害生物防治</p><p>　　1.2.

39、1 植物病害生物防治的概念</p><p>　　生物防治，簡單來說，就是利用自然界中的有益生物來防治病蟲害。而植物病害生物防治又稱植物病害綜合治理，是指利用有益微生物的生理生化特征以及其生態(tài)學(xué)作用，降低病原物數(shù)量或減弱病原的致病活力，從而達(dá)到防治植物病害的效果[8]。事實(shí)上，這種治理方法就是利用植物、病原物、有益微生物在自然生長環(huán)境中的相互關(guān)系，來達(dá)到抑制病原物生長或降低其毒力的目的，并同時(shí)促進(jìn)植物生長[9]。比

40、如，自然界中存在一些微生物，它們通過抗生作用（Antibiosis）、營養(yǎng)和空間競(jìng)爭(zhēng)（Competitive activity ）、重寄生作用（Hyperparasitism ）以及誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（Induced systemic resistance ）等機(jī)理能有效控制病原物的數(shù)量，以降低或消除病原物的危害[9]；而植物病害生物防治方法正好是利用這類微生物的生物學(xué)作用來防治植物病害。 </p><p>　　1.2

41、.2 植物病害生物防治的發(fā)展前景</p><p>　　目前，環(huán)境保護(hù)成為全世界最關(guān)注的話題，“資源節(jié)約型，環(huán)境友好型”產(chǎn)業(yè)已逐漸成為國際公認(rèn)的發(fā)展潮流。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面，可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略要求發(fā)展“綠色”產(chǎn)業(yè)，生產(chǎn)無污染的“綠色”農(nóng)產(chǎn)品，因此生物防治作為一種環(huán)境友好型的綜合防治措施在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中具有重要的開發(fā)和利用價(jià)值。</p><p>　　1987年，美國國家科學(xué)院有關(guān)專家把生物防治定義為：

42、“利用自然的或經(jīng)過改造的生物、基因或基因產(chǎn)物來減少有害生物的作用，使其有利于有益生物，如作物、樹木、動(dòng)物和益蟲及微生物”。從生物防治的定義上來看，這種方法實(shí)際上是利用自然界的發(fā)展規(guī)律來解決問題，因此不會(huì)破壞自然規(guī)律，更不會(huì)對(duì)人類社會(huì)的發(fā)展造成威脅。與其他的防治措施相比，生物防治對(duì)人類以及其他生物沒有毒害作用，也不會(huì)破壞自然界的生態(tài)平衡，完全符合農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的要求，具有很大的研究價(jià)值。</p><p>　　生

43、物防治方法涉及到生物間的互作關(guān)系，同時(shí)也與每種生物在自然界中的生態(tài)適應(yīng)性相關(guān)。而同一生物在不同的生態(tài)體系中的適應(yīng)能力以及其他相關(guān)特性會(huì)有所不同，這可能會(huì)影響到其穩(wěn)定有效的發(fā)揮生物防治作用。比如，在實(shí)驗(yàn)室條件下所開發(fā)出的生防菌在被引入到自然生態(tài)環(huán)境中后，它能否很快適應(yīng)自然生態(tài)環(huán)境，能否仍很好的定殖到植物體并與植物建立和諧關(guān)系，能否仍維持其強(qiáng)大的競(jìng)爭(zhēng)能力，決定了它在自然界生態(tài)系統(tǒng)中防治植物病害的能力。所以，對(duì)生物防治的研究，重點(diǎn)是要保證所開

44、發(fā)的生防因子能夠在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中有效且穩(wěn)定的發(fā)揮其生物防治作用，理想的生防菌應(yīng)具有營養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)能力強(qiáng)，抗菌物質(zhì)產(chǎn)生量高，生長速度快及適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)[10]。但是，目前，生物防治研究仍處于實(shí)驗(yàn)室階段，許多生防菌的田間防治效果并不穩(wěn)定，因此還不能廣泛應(yīng)用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中。</p><p>　　為了開發(fā)出理想的生防菌，國內(nèi)外相關(guān)研究主要采取以下措施：①變單一菌劑的使用為多菌混合使用，利用不同微生物的抗病機(jī)制，延長有效期并提

45、高防治病害的廣譜性；②對(duì)現(xiàn)有的野生型生防細(xì)菌進(jìn)行基因改造，以獲得廣譜高效的新型生物農(nóng)藥；③對(duì)病原物的流行和生態(tài)學(xué)進(jìn)行更多的研究，使環(huán)境和操作更有利于生防微生物作用的發(fā)揮；④解決活菌制劑的保藏和生防菌種的復(fù)壯兩大生物防治產(chǎn)品開發(fā)的難題[11]。</p><p>　　1.2.3 分子生物學(xué)技術(shù)在研究植物病害生物防治機(jī)制中的應(yīng)用</p><p>　　在先進(jìn)的科學(xué)技術(shù)條件支持下，國內(nèi)外研究人員對(duì)自

46、然界中許多典型的生防菌的生防機(jī)制進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)不同的生防菌發(fā)揮生防作用的機(jī)理不同，但概括起來主要包括：營養(yǎng)和空間位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)、拮抗作用、誘導(dǎo)植物抗病抗性、重寄生、溶菌等作用機(jī)制[12]。目前在生防菌生防機(jī)制的研究中，遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)和轉(zhuǎn)座子插入突變技術(shù)成為人們的研究熱點(diǎn)。</p><p>　　細(xì)菌的遺傳轉(zhuǎn)化(transformation) 是指處于感受態(tài)的受體菌吸收外源DNA 片段，并將其整合在自己的染色體上，獲得新的

47、穩(wěn)定的可遺傳的性狀的過程[13] 。轉(zhuǎn)化技術(shù)已成為重組DNA 技術(shù)的一項(xiàng)基本操作方法,廣泛應(yīng)用于基因定位、基因克隆、外源基因表達(dá)、基因圖譜繪制 [14,15]等研究方面。從自然界中篩選的生防菌往往需要進(jìn)行基因工程改造，才能成為理想的生防因子。目前對(duì)生防菌遺傳轉(zhuǎn)化的方法主要有感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法。孫會(huì)剛[16]等人通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，建立了攜帶轉(zhuǎn)座子Tn917 質(zhì)粒p- TV1 對(duì)枯草芽孢桿菌NCD22 野生菌株的轉(zhuǎn)化體系；

48、王玉飛[17]等人采用電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的方法, 成功將獲得含轉(zhuǎn)座子Tn917 質(zhì)粒pLTV3轉(zhuǎn)化到炭疽桿菌A16R，獲得炭疽桿菌芽孢形成缺陷突變株。</p><p>　　1951年Barbara Mclintock首先在玉米中發(fā)現(xiàn)了控制元件，后來命名為轉(zhuǎn)座元件或轉(zhuǎn)座子 (transposon) [18]。轉(zhuǎn)座子又稱跳躍因子,是基因組中一段不必借助于同源序列就可移動(dòng)的DNA序列，它們可以直接從基因組內(nèi)的一個(gè)位點(diǎn)移

49、到另一個(gè)位點(diǎn)，甚至可在質(zhì)粒之間，質(zhì)粒和染色體之間,質(zhì)粒和轉(zhuǎn)導(dǎo)的噬菌體之間來回轉(zhuǎn)移，并能引起靶基因的變異、失活[19]。目前，轉(zhuǎn)座子不僅可用于分析生物遺傳進(jìn)化上分子作用引起的一些現(xiàn)象，還為基因工程和分子生物學(xué)研究提供了強(qiáng)有力的工具[20,21]，可以在不了解基因產(chǎn)物的生化性質(zhì)和表達(dá)模式的情況下，分離克隆植物基因，即轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽[22](transposon tagging)。其原理是利用轉(zhuǎn)座子的插入造成基因突變，以轉(zhuǎn)座子序列為基礎(chǔ)，從突變株

50、的基因文庫中篩選出帶有此轉(zhuǎn)座子的克隆，它必定含有與轉(zhuǎn)座子序列相鄰的突變基因的部分序列，再利用這部分序列從野生型基因文庫中獲得完整的基因。</p><p>　　在生物防治機(jī)制研究中，人們首先通過遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將攜帶轉(zhuǎn)座子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到生防菌細(xì)胞內(nèi)，之后通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座技術(shù)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座子發(fā)生轉(zhuǎn)座，從質(zhì)粒載體上隨機(jī)插入到生防菌基因組上，從而獲得生防菌的突變體，建立相關(guān)突變體庫；在得到某個(gè)生防菌的突變體庫后，從突變體庫中篩選控制生防

51、菌某個(gè)性狀表達(dá)的相關(guān)功能基因的缺陷突變株，通過反向PCR技術(shù)以及DNA序列測(cè)序技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列進(jìn)行測(cè)序，獲得與生防菌株某個(gè)性狀相關(guān)的功能基因；之后再利用其他分子生物學(xué)手段對(duì)該功能基因進(jìn)行研究，探索其與生防菌株生防能力之間的關(guān)系，進(jìn)而探索生防菌的生防機(jī)制[23]。</p><p>　　1.3 植物內(nèi)生生防細(xì)菌</p><p>　　1.3.1 植物內(nèi)生細(xì)菌的概念</p&g

52、t;<p>　　隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們?cè)谥参锊『ι锓乐窝芯糠矫嫒〉煤艽筮M(jìn)步，許多研究發(fā)現(xiàn)自然界中植物病害的生防菌種類繁多，主要包括放線菌、真菌、細(xì)菌等。放線菌主要以鏈霉菌及其變種[24]為代表；真菌以酵母菌、盾殼霉、木霉菌、毛殼菌、粘帚霉等[25]為代表；細(xì)菌以假單胞桿菌、芽孢桿菌、巴氏桿菌以及放射性土壤桿菌[26]為典型。</p><p>　　近年來，人們發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生細(xì)菌作為生防細(xì)菌中的一大類

53、，是最具潛在應(yīng)用和開發(fā)價(jià)值的生防因子。田宏先[27]等報(bào)道了馬鈴薯組織內(nèi)生菌對(duì)馬鈴薯莖基腐病的田間防治及增產(chǎn)作用。Hinton[28] 等也通過試驗(yàn)證明, 玉米內(nèi)生陰溝桿菌(Enterobactercloacae) 作為種子保護(hù)劑,能有效防治玉米病害。1992年，克洛珀(Kloepper)等人提出了植物內(nèi)生細(xì)菌的概念，他們認(rèn)為植物內(nèi)生細(xì)菌(endophytic bacteria)是指能夠定殖在健康植物各種組織和器官的細(xì)胞間或細(xì)胞內(nèi)，并與

54、植物建立和諧聯(lián)合關(guān)系的一類微生物 [29,30]。這類細(xì)菌與寄主植物在長期共同進(jìn)化過程中形成密切的相互關(guān)系，且生存微環(huán)境穩(wěn)定，成為化肥、農(nóng)藥和其他微生態(tài)制劑的最佳競(jìng)爭(zhēng)者，它的合理應(yīng)用將減少化學(xué)藥劑造成的環(huán)境污染，提高農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性，有利于保持生態(tài)平衡。</p><p>　　1.3.2 植物內(nèi)生芽孢桿菌在生物防治研究中的應(yīng)用</p><p>　　在植物內(nèi)生生防細(xì)菌這個(gè)大群體中，芽孢

55、桿菌是一類典型代表。芽孢桿菌能產(chǎn)生芽孢，對(duì)干燥、高溫、紫外輻射等惡劣環(huán)境具有很強(qiáng)的抵抗能力，在植物的表面易于存活、定殖，而且其抑菌范圍比較廣泛，能有效防治許多病原真菌的所引起的植物病害[31]。另外，芽孢桿菌具有對(duì)人畜無毒無害，不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)；在生產(chǎn)芽孢桿菌制劑方面，工藝簡單，不易產(chǎn)生抗藥性，施用方便，符合現(xiàn)代社會(huì)對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及有害生物綜合防治( IPM) 的要求，因此成為生物防治研究中的研究重點(diǎn)。在近年來對(duì)土壤傳播病害以及種傳病害的

56、研究中，已發(fā)現(xiàn)許多芽孢桿菌成功防治植物病害的成功例子，這些芽孢桿菌主要包括枯草芽抱桿菌(B.subtilis)，多粘芽抱桿菌(B.polymyxa)、蠟狀芽抱桿菌(B.cereus)和巨大芽抱桿菌(B.megaterium )[31]。如易有金[32]等研究發(fā)現(xiàn), B. subtilis B - 001菌株可通過自然孔口和傷口入侵寄主植物,取接種植株的莖部組織切片在電鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)該菌株在煙草的微管束和細(xì)胞內(nèi)定殖。L.Cavaglier

57、i[33]篩選出來的B.subtilis CE1可以在玉米根部的表面及內(nèi)部迅速的定殖</p><p>　　1.3.3 植物內(nèi)生生防細(xì)菌與其生防能力相關(guān)特性</p><p>　　（1） 植物內(nèi)生生防細(xì)菌的定殖能力</p><p>　　許多研究[34,35]表明,生防菌的定殖能力是決定其發(fā)揮穩(wěn)定生防效果的關(guān)鍵因素，理想的生防菌應(yīng)該能很好的定殖在作物體或作物根際。定殖是指

58、微生物在植物體某個(gè)特定部位或是植物根際繁殖并持續(xù)其種群的能力[36]。利用基因標(biāo)記、抗生素標(biāo)記、同位素跟蹤、熒光標(biāo)記、掃描電鏡觀察等方法對(duì)生防菌的定殖情況進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)，在作物根表，生防菌主要定殖在表皮細(xì)胞間隙或裂縫處，以及側(cè)根、根毛或其它突起物基部；另外發(fā)現(xiàn)，生防菌隨種子表面擴(kuò)展到根后，迅速占據(jù)上述部位，并大量增殖，大大提高種群密度，從而通過種群優(yōu)勢(shì)以抑制其他有害或無害微生物的生長和繁殖，同時(shí)減少病原物的侵染機(jī)會(huì)，以促進(jìn)植物的生長[3

59、7]。 </p><p>　　生防菌的定殖能力與很多因素相關(guān)，如生防菌自身的遺傳學(xué)特性,其對(duì)根部分泌物的利用能力[38],植物和土著微生物種類[39]以及土壤環(huán)境因子等。 Liljeroth[40]等證明:在小麥根的較老部位定殖的細(xì)菌與在根尖定殖的細(xì)菌的生理型很不一樣,尤其是對(duì)基質(zhì)利用的?；圆煌?。Korber等利用雙稀釋連續(xù)培養(yǎng)(Dua1一Diluitno Continuous Cluture)和批量培養(yǎng)體系(

60、Batch Culture Systms)分析細(xì)菌運(yùn)動(dòng)能力與其定殖能力的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力其在定殖過程中具有決定性的作用[41]。在了解生防菌的定殖能力以及其影響因素后，我們可以通過分子生物學(xué)技術(shù)等手段對(duì)生防菌進(jìn)行改良，提高其在作物體或作物根際的定殖能力，為其發(fā)揮穩(wěn)定的生防能力提供保障。</p><p>　?。?）植物內(nèi)生生防細(xì)菌生物薄膜形成能力</p><p>　　生物薄膜(bio

61、film)是指微生物菌體互相黏附在一起或附著到一些生物或非生物表面上，并包埋在胞外多聚物基質(zhì)中的生長狀態(tài)[42]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，生物薄膜實(shí)際上是一個(gè)微小生境，該生境與周圍環(huán)境可能有著明顯的區(qū)別，從而使其中的細(xì)胞展現(xiàn)出區(qū)別于游離細(xì)胞的特性,因?yàn)樾纬蛇@一結(jié)構(gòu)后，聚集成團(tuán)的群體細(xì)胞能夠具有類似多細(xì)胞組織的功能及特性[43]。生物薄膜的形成有利于遺傳物質(zhì)的水平轉(zhuǎn)移，對(duì)細(xì)菌的環(huán)境適應(yīng)能力、進(jìn)化能力等有很大的影響；同時(shí)有利于提高細(xì)胞對(duì)藥物的抗性，并

62、能對(duì)外界環(huán)境條件改變作出快速的反應(yīng)，有利于減少環(huán)境變化帶來的不利影響，對(duì)于不利的環(huán)境變化，具有很強(qiáng)的抗性。</p><p>　　隨著對(duì)生防菌定殖能力影響因素的探索，許多研究發(fā)現(xiàn)，生防菌的定殖能力與其生物薄膜形成能力相關(guān)。植物內(nèi)生菌在植物體內(nèi)或體表定殖后表現(xiàn)出明顯的聚集成團(tuán)的生長行為，如形成聚集團(tuán)(aggregates)、微菌落(microcolonies)、共質(zhì)體(symplasmata)等形式的生物薄膜附著于植

63、物組織上。有研究發(fā)現(xiàn)，多粘類芽胞桿菌(Paenibacillus polymyxa)[44]、苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)[45]均以生物薄膜的方式定殖在宿主植物組織上；解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens) 在大豆種子上的定殖能力受其生物薄膜形成能力的影響 [46]。Achouak[47] 等報(bào)道的成團(tuán)腸桿菌( Enterobacter agglomerans) , 在水稻根面定殖過

64、程中形成的菌體細(xì)胞簇連而成的凝塊狀結(jié)構(gòu),有對(duì)宿主水稻的定殖專一性。Morris CE[48] 等觀察到在許多植物葉表面定殖的多種細(xì)菌有60％～80％是以聚集形式存在。Monier[49]發(fā)現(xiàn)丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)的細(xì)胞在植物葉片表面定殖后</p><p>　　目前對(duì)生物薄膜結(jié)構(gòu)和功能的研究已成為植物微生物相互作用研究的熱點(diǎn)，了解生物薄膜形成與生防菌定殖能力的相關(guān)性，對(duì)植物一微生物

65、相互作用的理論研究有著重要價(jià)值，同時(shí)有利于研究如何提高生防菌定殖能力，進(jìn)而保證生防菌在田間發(fā)揮穩(wěn)定的生防作用。</p><p>　　1.4 立題依據(jù)和研究意義</p><p>　　小麥紋枯病是一種嚴(yán)重影響小麥產(chǎn)量的土壤傳播病害?；瘜W(xué)防治易造成環(huán)境污染；輪作效果不穩(wěn)；目前也沒有對(duì)小麥紋枯病產(chǎn)生免疫的小麥品種。生物防治作為一種安全無污染、有效的植物病害綜合治理方法是防治小麥紋枯病的理想措施。&

66、lt;/p><p>　　近年來，有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生細(xì)菌因其能在植物體定殖，具有較強(qiáng)的營養(yǎng)和位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)力，并能與植物體建立和諧關(guān)系，是一類最具潛力的生防因子。芽孢桿菌是植物內(nèi)生細(xì)菌中的典型生防細(xì)菌，具有對(duì)人畜無毒無害，不污染環(huán)境，在植物的表面易于存活、定殖等優(yōu)點(diǎn),而且生產(chǎn)芽孢桿菌制劑的工藝簡單,不易產(chǎn)生抗藥性，施用方便。因此，目前對(duì)芽孢桿菌生防制劑的開發(fā)已成為生物防治研究中的熱點(diǎn)。</p><p&g

67、t;　　在生防菌的開發(fā)過程中，人們發(fā)現(xiàn)生防菌株的定殖能力是影響其發(fā)揮穩(wěn)定生防作用的關(guān)鍵因素，因此，研究影響生防菌定殖能力的因素成為通往成功開發(fā)生防制劑道路中的關(guān)鍵。隨著人們對(duì)影響細(xì)菌定殖能力因素的研究，發(fā)現(xiàn)生物薄膜作為細(xì)菌在自然界中的主要存在方式，在植物- 細(xì)菌相互作用中扮著重要角色；而且有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)生物薄膜的形成與細(xì)菌的定殖能力之間存在相關(guān)性。</p><p>　　然而，目前并沒有分子生物學(xué)證據(jù)來證明，生防細(xì)

68、菌生物薄膜的形成能影響其在作物體或作物根際的定殖能力，從而進(jìn)一步影響其生物防治能力。因此，本研究試圖利用研究生防菌生防機(jī)制的研究思路和手段，通過建立生防菌0-9的突變體庫，從突變體庫中篩選生物薄膜形成能力缺陷突變株，并對(duì)突變株和野生型菌株的定殖能力以及生防能力進(jìn)行比較，尋找生物薄膜形成與菌株定殖能力以及生防能力之間的關(guān)系。在整個(gè)研究思路中，建立突變體庫是重中之重，是研究的基礎(chǔ)。一個(gè)理想的突變體庫，其插入突變位點(diǎn)應(yīng)具有隨機(jī)性。2006年，

69、Yoann Le Breton[52]等人報(bào)道了質(zhì)粒pMarB上所攜帶的轉(zhuǎn)座子TnYLB-1具有高效的轉(zhuǎn)座效率，并且能隨機(jī)插入宿主基因組上。因此本文試圖通過原生質(zhì)體電擊轉(zhuǎn)化方法，將攜帶轉(zhuǎn)座子TnYLB-1的質(zhì)粒pMarB轉(zhuǎn)化到植物內(nèi)生生防芽孢桿菌 0-9的細(xì)胞內(nèi)，并通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座，建立0-9的轉(zhuǎn)座插入突變體庫；同時(shí)，通過Southern雜交技術(shù)和PCR從分子水平上對(duì)突變體庫進(jìn)行評(píng)價(jià)；并通過比較突變株和野生菌株0-9的生物薄膜形成能力、定殖

70、能力、生物防治能力等特性，對(duì)突變體庫進(jìn)行表型評(píng)價(jià)。建立生防芽孢桿菌0-9的突</p><p><b>　　2 材料與方法</b></p><p><b>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p>　　2.1.1 菌株及質(zhì)粒</p><p><b>　?。?） 供試菌株：</b&g

71、t;</p><p>　　菌株0-9：由本實(shí)驗(yàn)室劉鳳英等人從拔節(jié)期健康小麥苗根部分離保存的蠟樣芽胞桿菌，能定殖在小麥根際和根內(nèi)，具有產(chǎn)幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、蛋白酶的能力，運(yùn)動(dòng)能力較強(qiáng)，能在非生物物質(zhì)表面附著并形成生物薄膜，同時(shí)對(duì)小麥紋枯病具有較好生防效果，在實(shí)驗(yàn)室條件下其防治效果可達(dá)82.86%[53]。 </p><p>　　Escherichia coli GM2163：甲基化缺陷型菌株

72、，購自于Fermentas公司。</p><p><b>　?。?） 供試質(zhì)粒：</b></p><p>　　pMarB[52]，片段大小為8319 bp，含有轉(zhuǎn)座子TnYLB-1，溫度敏感型復(fù)制子repG+ts（30 ℃復(fù)制,50 ℃不能復(fù)制)。質(zhì)粒骨架上面含有紅霉素（Erm）抗性基因，轉(zhuǎn)座子上面帶有卡那霉素（Kan）抗性基因，如圖2-1所示。</p>

73、<p>　　2.1.2 供試小麥</p><p>　　矮抗58，購自開封種子公司。</p><p>　　2.1.3 供試病原真菌</p><p>　　禾谷絲核菌（R..cerealis），由本實(shí)驗(yàn)室劉鳳英等人從發(fā)病小麥植株分離，保存于4 ℃，具有較強(qiáng)的致病能力[53]。</p><p><b>　　2.1.4 培養(yǎng)基&l

74、t;/b></p><p>　　LB：10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g NaC1，20 g瓊脂，1 000 mL蒸餾水，pH 7.2，121 ℃滅菌20 min。</p><p>　　PDA：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，20 g瓊脂，1 000 mL蒸餾水，121 ℃滅菌20 min，pH自然。</p><p>　　麥粒沙培養(yǎng)基：將適量小麥粒

75、于水中浸泡1 h，沸水煮1 h，撈出控干后稱量，按小麥濕重與葡萄糖重量比，稱取1%的葡萄糖與小麥粒拌勻，再按小麥濕重與砂土重量比1:1混合拌勻，分裝，121 ℃滅菌1 h。</p><p>　　SOB：0.05%NaCl，0.5%酵母提取物，2%胰蛋白胨，10 mL 250 mmol/L KCl溶液，NaOH調(diào)pH值至7.0，用雙蒸水定容到1L，121 ℃滅菌20 min。使用時(shí)，加入5 mL 2 mol/L的無

76、菌MgCl2 [54]。</p><p>　　SOC：SOB，20 mmol/L葡萄糖[54]。</p><p>　　PAB：10 g蛋白胨，1.5 g酵母提取物，1.5 g牛肉膏，3.5 g NaCl，1.0 g葡萄糖，3.68 g K2HPO4，1.32 g KH2PO4，NaOH調(diào)pH值至7.0，用蒸餾水定容到1 L；</p><p>　　SMM：1 mol/

77、L蔗糖，0.04 mol/L馬來酸，0.04 mol/L MgCl2，溶解后用NaOH調(diào)pH值至6.5，雙蒸水定容到1 L，121 ℃滅菌20 min。</p><p>　　DM3：0.8%瓊脂粉，45.55 g甘露醇，5 g酸水解酪素，5 g酵母提取物，3.5 g K2HPO4，1.5 g KH2PO4，5 g葡萄糖，4.07 g MgCl2，雙蒸水定容到1 L，120 ℃滅菌20 min。使用時(shí)，待培養(yǎng)基溫度

78、為55 ℃時(shí)加入0.1 g BSA。</p><p>　　BGM：LB，0.015 mmol/L硫酸銨，10 mmol/L磷酸鉀(pH7.0)，3.4 mol/L檸檬酸鈉，1 mmol/L硫酸鎂，0.1%葡萄糖(w/v)，雙蒸水定容到1 L，120 ℃滅菌20 min。</p><p>　　Msgg：5 mmol/L磷酸鉀(pH7.0)，100 mmol/L MOPS(pH7.0)，2 m

79、mol/L MgCl2，700 µmol/L CaCl2，50 µmol/L MnCl2，50 µmol/L FeCl2，1 µmol/L ZnCl2，2 µmol/L VB1，0.5%甘油，0.5%谷氨酸，50 µg/ml色氨酸，50 µg/ml苯丙氨酸，雙蒸水定容到1 L，120 ℃滅菌20 min。</p><p>　　EPS[55]：7

80、 g K2HPO4，3 g KH2PO4，0.1 g MgSO4·7H2O，0.01 g CaCl2，0.001 g FeSO4，0.1 g NaCl，1 g葡萄糖，0.125 g酵母提取物，雙蒸水定容到1 L，120 ℃滅菌20 min。</p><p><b>　　2.1.5 試劑</b></p><p>　　（1） 質(zhì)粒提取所需試劑參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指

81、南》第三版： </p><p>　　溶液I[54]：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH8.0），10 mmol/L EDTA（pH8.0），121 ℃ 滅菌15 min，4 ℃保存。</p><p>　　溶液II[54]：0.2 N NaOH，1% SDS（m/V），新鮮配制，室溫下使用。</p><p>　　溶液III[54]：60

82、 mL 5 mol/L乙酸鉀，11.5 mL冰乙酸，28.5 mL H2O，4 ℃保存。</p><p>　　溶液IV[54]：酚:氯仿:異戊醇（v/v）：25:24:1</p><p>　　無水乙醇，75%乙醇</p><p>　?。?） 質(zhì)粒DNA純化回收試劑盒：</p><p><b>　　購自鼎國生物公司。</b>

83、;</p><p>　　（3） 芽孢桿菌基因組DNA提取所需試劑：</p><p>　　CTAB/ NaCl溶液：4.1 g NaCl溶解于80 ml H2O，緩慢加入10 g CTAB，加水至100 ml；</p><p>　　氯仿:異戊醇（v/v）：24:1；酚:氯仿:異戊醇（v/v）：25:24:1；</p><p>　　TE：10 m

84、mol/L Tris-Cl（pH 8.0），1 mmol/L EDTA（pH 8.0）；</p><p>　　RNase：用TE緩沖液溶解RNA酶，使終濃度為20 µg/mL，-20 ℃貯存?zhèn)溆茫?lt;/p><p>　　異丙醇，75%乙醇，蛋白酶K(20 mg/ml)，5 mol/L NaCl，10% SDS。</p><p><b>　?。?）

85、抗生素：</b></p><p>　　卡那霉素（Kan）：用水溶解配制成0.1 g/mL母液，過濾除菌，-20 ℃貯存?zhèn)溆?，使用的終濃度為50 µg/mL。</p><p>　　紅霉素（Erm）：用乙醇溶解配制成0.25 mg/mL母液，過濾除菌，-20 ℃貯存?zhèn)溆茫褂玫慕K濃度為10 µg/mL。</p><p><b>

86、　?。?） 酶：</b></p><p>　　EcoRI，PstI等購自寶生物工程有限公司。</p><p><b>　?。?） PCR：</b></p><p>　　dNTP，Taq酶，10×Taq buffer，購自萊楓生物公司。</p><p>　　引物：以轉(zhuǎn)座子TnYLB-1的序列作為模板，

87、用引物設(shè)計(jì)件軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，由上海生工合成。</p><p>　　①BKmF/BKmR：擴(kuò)增產(chǎn)物為1.2 Kb</p><p>　?、贏TnB/STnR：擴(kuò)增產(chǎn)物為500 bp</p><p>　?。?） Southern 雜交：</p><p>　　雜交試劑盒：DIG High Prime DNA Labeling a

88、nd Detection Starter Kit I</p><p>　　洗滌緩沖液: 0.1 mol/L Maleic acid, 0.15 mol/L NaCl, 0.3% (v/v) Tween20, </p><p>　　馬來酸緩沖液: 0.1 mol/L Maleic acid, 0.15 mol/L NaCl, pH7.5</p><p>　　檢測(cè)緩沖液

89、: 0.1 mol/L Tris-Cl, 0.1 mol/L NaCl, pH9.5</p><p>　　TE緩沖液: 10 mmol/L Tris-Cl, 1 mmol/L EDTA, Ph8.0</p><p>　　20×SSC: 在800 ml水中溶解175.3 g NaCl和88.2 g檸檬酸鈉，加入數(shù)滴10 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，加雙蒸水定容至1

90、L，分裝后滅菌。</p><p><b>　?。?） 電泳：</b></p><p>　　10 mg/mL溴化乙錠，50× TAE (儲(chǔ)存濃度)，1× TAE (工作濃度)，</p><p>　　0.7%瓊脂糖凝膠，10× loading buffer</p><p>　　Marker：25

91、0 bp-10 Kb購自萊楓生物公司。</p><p><b>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　2.2.1 生防芽孢桿菌0-9原生質(zhì)體電擊轉(zhuǎn)化</p><p>　　（1） 質(zhì)粒pMarB（攜帶轉(zhuǎn)座子TnYLB-1）的準(zhǔn)備：</p><p>　?、儋|(zhì)粒pMarB電擊轉(zhuǎn)化E.coli GM2163：&l

92、t;/p><p>　　E.coli GM2163是限制-修飾系統(tǒng)缺陷的突變株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株，這樣能確保轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒能夠穩(wěn)定復(fù)制，所攜帶的基因能順利表達(dá)。本文通過電擊轉(zhuǎn)化方法[56]，將質(zhì)粒pMarB轉(zhuǎn)化到E.coli GM2163細(xì)胞內(nèi)，pMarB上的復(fù)制子repG+ts可以借助宿主菌的復(fù)制體系，使質(zhì)粒在宿主菌細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制，從而為后面的研究工作提供充足的質(zhì)粒資源。</p><

93、;p>　　a、制備E.coli GM2163電擊感受態(tài)：</p><p>　　在LB平板上劃線培養(yǎng)E.coli GM2163，挑取單菌落至50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)16 h；按照2% 接種量轉(zhuǎn)接菌液至新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600≈0.4；將裝有菌液的培養(yǎng)瓶置于冰水混合物中冷凍30 min；待菌液徹底冷卻后，將其轉(zhuǎn)移至預(yù)冷離心管內(nèi)，60

94、00 r/min低溫冷凍離心10 min，棄上清，加入預(yù)冷無菌雙蒸水重懸浮菌體，再次冷凍離心收集菌體；加入預(yù)冷的無菌10%(v/v)甘油重懸浮菌體，6000 r/min低溫冷凍離心10 min，棄上清，此步驟重復(fù)兩次；最后用預(yù)冷10%(v/v)甘油重懸浮菌體，使細(xì)胞濃度達(dá)到3×1013 cell/mL[57]；分裝感受態(tài)細(xì)胞，每管50 µL，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　b、質(zhì)粒p

95、MarB電擊轉(zhuǎn)化E.coli GM2163感受態(tài)細(xì)胞：</p><p>　　將感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)粒pMarB分別從冷凍冰箱取出后，置于冰上使融化；按照一定比例（質(zhì)粒DNA：50 ng；感受態(tài)細(xì)胞：50 µL），混合質(zhì)粒和感受態(tài)細(xì)胞，并將混合物轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電擊杯（1 mm）中；在電阻400 Ω，電容5 µF，電壓2.0 kv電擊參數(shù)條件下電擊一次，迅速向電擊杯中加入恢復(fù)培養(yǎng)基SOC；將電擊杯中的菌懸

96、液吸出，轉(zhuǎn)入無菌管中，于30 ℃，100 r/min恢復(fù)培養(yǎng)，1 h后，向菌懸液中加入Erm(0.04 µg/mL)誘導(dǎo)抗性，繼續(xù)恢復(fù)培養(yǎng)2 h；恢復(fù)培養(yǎng)結(jié)束后，將菌懸液涂布LB(Kan 50 µg/mL,Erm 10 µg/mL)平板，30 ℃靜置培養(yǎng)過夜；待平板上出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子，挑取轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，用PstI酶切質(zhì)粒，電泳驗(yàn)證轉(zhuǎn)化是否成功。</p><p><b>　

97、　②質(zhì)粒抽提：</b></p><p>　　在LB雙抗平板上劃線培養(yǎng)質(zhì)粒pMarB的宿主菌E.coli GM2163，挑取單菌落至50 mL LB液體培養(yǎng)基中，并加入抗生素Kan（50 µg/mL）和Erm（10 µg/mL），30 ℃，200 r/min培養(yǎng)24 h。之后收集菌體，采用SDS堿裂解法[54]提取質(zhì)粒pMarB。具體操作步驟如下：</p><p&

98、gt;　　取1.5 mL菌懸液，12000 r/min離心1 min；棄上清，加入100 µL溶液I，渦旋使充分混勻；沿離心管壁加入200 µL新鮮配制的溶液II，輕柔顛倒4~5次，冰浴3~5 min（冰浴時(shí)間不能超過5 min）；冰浴完成后迅速向管內(nèi)加入150 µL溶液III，輕柔顛倒4~5次，冰浴3~5 min，之后在低溫條件下(4 ℃)，12000 r/min離心5 min；將上清轉(zhuǎn)入新的1.5 mL

99、 離心管中，加入等體積溶液IV，反復(fù)上下顛倒，混合均勻，在低溫條件下（4 ℃），12000 r/min離心5 min；將上清轉(zhuǎn)入新的1.5 mL 離心管中，加入兩倍體積冰冷無水乙醇，輕輕顛倒混勻，室溫沉淀20 min，在低溫條件下（4 ℃），12000 r/min離心5 min，收集沉淀；用70%乙醇洗滌沉淀，37 ℃干燥，最后將獲得的質(zhì)粒DNA溶于20 µL TE中，置于-20 ℃保存；0.7% 瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證質(zhì)粒抽提效

100、果。</p><p><b>　?、勖盖序?yàn)證：</b></p><p>　　根據(jù)pMarB質(zhì)粒圖譜上顯示的酶切位點(diǎn)[52]，用PstI對(duì)提取的質(zhì)粒pMarB進(jìn)行酶切</p><p>　　驗(yàn)證。采用20 µL的酶切反應(yīng)體系（表2-1），于37 ℃水浴4 h，0.7% 瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。</p><p>&l

101、t;b>　?、苜|(zhì)粒純化：</b></p><p>　　用質(zhì)粒DNA純化回收試劑盒純化提取獲得的質(zhì)粒pMarB，最后用無菌ddH2O溶解，</p><p>　　電泳驗(yàn)證純化回收效率，并估計(jì)質(zhì)粒濃度。剩余質(zhì)粒保存于-20 ℃。</p><p>　　表2-1 PstI酶切pMarB反應(yīng)體系</p><p>　　TABLE.2-1

102、Reaction conditions of PstI</p><p>　　注：酶切條件為37 ℃水浴4 h。</p><p>　?。?）生防芽孢桿菌0-9原生質(zhì)體的制備以及電擊轉(zhuǎn)化：</p><p>　　①測(cè)定0-9生長曲線： </p><p>　　從低溫冰箱中取出保存的菌株0-9劃線于LB平板，30 ℃靜置培養(yǎng)至長出單菌落；挑取單菌

103、落于50 mL PAB液體培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min培養(yǎng)過夜；按2%接種量，轉(zhuǎn)接過夜培養(yǎng)物于新鮮的50 mL PAB液體培養(yǎng)基中，同時(shí)接種三瓶作為重復(fù)處理，放置在4 ℃冷凍24 h，使三個(gè)培養(yǎng)瓶中的細(xì)菌處于相同的生長狀態(tài)；冷凍24 h后，取出培養(yǎng)瓶，于37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔0.5 h取樣150 µL，并將樣品置于低溫冰箱，使細(xì)菌生長停止，直至24 h后，取樣完成；將樣品分別加入96孔板，用酶標(biāo)儀

104、檢測(cè)菌懸液的OD570值，繪制生長曲線；根據(jù)生長曲線估計(jì)當(dāng)細(xì)菌生長到對(duì)數(shù)期中期時(shí)的OD570值以及所需培養(yǎng)時(shí)間，為制備原生質(zhì)體提供理論數(shù)據(jù)。</p><p>　?、?-9原生質(zhì)體的制備[58]：</p><p>　　LB平板劃線30 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單菌落于50 mL PAB液體培養(yǎng)基中，30 ℃，</p><p>　　200 r/min培養(yǎng)過夜；</p>

105、;<p>　　b、按2%接種量，轉(zhuǎn)接過夜培養(yǎng)物于新鮮的50 mL PAB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)至細(xì)菌生長對(duì)數(shù)期中期；</p><p>　　c、6000 r/min離心10 min收集菌體，棄上清，加入20 mL SMM重懸??；</p><p>　　d、重復(fù)步驟c，之后取出100 µL菌懸液稀釋至10-3、10-4分別涂布LB平板，培養(yǎng)&l

106、t;/p><p>　　過夜后計(jì)數(shù)平板菌落，計(jì)算原始菌濃度并記作Y；</p><p>　　e、向剩下菌懸液中加入適量溶菌酶，在適當(dāng)條件下反應(yīng)一段時(shí)間，直到原生質(zhì)體</p><p>　　形成，不同芽孢桿菌的反應(yīng)條件以及反應(yīng)時(shí)間不同，因此本文設(shè)置了破解細(xì)胞壁反應(yīng)條件的不同組合：A：溶菌酶終濃度0.25 mg/mL，42 ℃反應(yīng)45 min；B：溶菌酶終濃度2 mg/mL，40

107、 ℃反應(yīng)45 min ；C：溶菌酶終濃度10 mg/mL，37 ℃反應(yīng)90 min；D：溶菌酶終濃度20 mg/mL，37 ℃反應(yīng)30 min；通過試驗(yàn)探索最優(yōu)組合；</p><p>　　f、4000 r/min離心10 min收集原生質(zhì)體，用SMM洗滌原生質(zhì)體兩次，最后根據(jù)收集</p><p>　　沉淀的多少，加入適量的SMM重懸浮，使原生質(zhì)體濃度達(dá)到1010 cell/mL，最后分裝，