水分脅迫下外源脫落酸提高甘蔗抗旱性的機(jī)理研究.pdf

1、甘蔗是中國第一大糖料作物，甘蔗糖占我國食糖總產(chǎn)量90％以上，而我國甘蔗種植面積80％以上為丘陵旱地，蔗區(qū)農(nóng)業(yè)水利條件較差，降水不均衡，土壤保水能力差，每年都面臨不同程度干旱威脅。選育抗旱性強(qiáng)、水分利用率高的甘蔗品種是我國甘蔗糖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要保證，但由于甘蔗遺傳背景復(fù)雜，通過常規(guī)雜交育種方法進(jìn)行甘蔗遺傳改良所需周期比較長，亟需其它輔助手段解決甘蔗抗旱性問題。本研究選用甘蔗品種桂糖21號(GT21)，比較在進(jìn)行水分脅迫和脅迫加噴施外源脫

2、落酸(ABA)處理?xiàng)l件下，甘蔗葉片內(nèi)相關(guān)生理生化變化及其與抗旱性的關(guān)系，運(yùn)用基因芯片比較兩處理?xiàng)l件下差異表達(dá)基因異同并篩選ABA誘導(dǎo)基因，對ABA合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程關(guān)鍵基因進(jìn)行克隆及表達(dá)分析，主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　 1.以GT21為材料，研究水分脅迫及脅迫加葉面噴施ABA對甘蔗內(nèi)源ABA含量及相關(guān)生理生化指標(biāo)的影響，結(jié)果表明，干旱及干旱加外施ABA條件下，甘蔗內(nèi)源ABA含量水平上升，但干旱加ABA處理增幅更顯著，甘蔗葉片

3、相對含水量隨著脅迫加劇而逐漸下降，外施ABA能提高甘蔗保水能力。水分脅迫下，甘蔗葉內(nèi)脯氨酸、可溶性蛋白、H2O2、丙二醛(MDA)含量增加，ABA處理能使?jié)B透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量處于更高水平，并降低MDA含量，緩解其積累給細(xì)胞帶來的傷害。水分脅迫及ABA處理均能提高GT21葉片中IAA含量而降低GA含量。ABA處理能防止葉綠素降解并對干旱引起的最大光能轉(zhuǎn)化效率（Fv/Fm）、最大光化學(xué)效率（Fv'/Fm'）、光系統(tǒng)Ⅱ?qū)嶋H量子效率(PS2)下降有

4、明顯緩解作用。在干旱條件下，H2O2積累伴隨著抗氧化系統(tǒng)相關(guān)酶CAT、GPX、GR和APX活性提高，ABA處理能進(jìn)一步提高上述酶活性而使活性氧清除能力得到增強(qiáng)，表明在干旱條件下，外施ABA處理能增強(qiáng)甘蔗抗氧化防護(hù)系統(tǒng)，從而提高其抗旱性。
　　 2.以已發(fā)表的NCED蛋白序列保守區(qū)域?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)簡并引物，運(yùn)用RT-PCR方法，從GT21中克隆得到NCED基因序列表達(dá)標(biāo)簽后，采用RACE-PCR技術(shù)，擴(kuò)增出該基因全長cDNA序列并命

5、名為SoNCED。序列分析表明SoNCED全長2521 bp，包含長度為1827 bp的開放閱讀框，編碼608個(gè)氨基酸，推導(dǎo)氨基酸序列分子量65.9kDa，等電點(diǎn)6.04，聚類分析表明其與玉米和高梁等同屬C4植物的NCED進(jìn)化關(guān)系較近。生物信息學(xué)分析表明，SoNCED的N末端有典型葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽結(jié)構(gòu)，組成其基本二級結(jié)構(gòu)的α-helices、β-strands、β-propeller、與鐵離子結(jié)合起催化作用的組氨酸位點(diǎn)，α-helices結(jié)

6、構(gòu)中富含疏水氨基酸殘基等，性質(zhì)高度保守。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果表明，25％PEG-6000模擬干旱脅迫處理、對照加ABA及干旱加ABA處理下，GT21葉片及根系SoNCED都隨著O2-產(chǎn)生速率升高表達(dá)量顯著上升，并與ABA含量增長具有協(xié)同效應(yīng)，表明SoNCED參與甘蔗葉片及根系內(nèi)源ABA合成調(diào)控。
　　 3.應(yīng)用安捷倫4×44 K基因芯片研究水分脅迫及脅迫加葉面噴施ABA對甘蔗基因表達(dá)的影響，結(jié)果表明，ABA處理在第3、第5

7、天差異表達(dá)基因數(shù)量均高于單施干旱處理;脅迫前期，兩處理差異基因以上調(diào)表達(dá)為主，后期下調(diào)表達(dá)占多數(shù)。從ABA處理第3天的樣品中篩選到231個(gè)ABA響應(yīng)基因，與第5天各處理差異基因相比，其中71個(gè)基因只在ABA處理第3天表達(dá)，72個(gè)在所有處理中共表達(dá)，38個(gè)只在ABA處理第3、第5天共表達(dá)，50個(gè)只在干旱處理第5天表達(dá)。使用BlastX對上述231個(gè)基因進(jìn)行功能注釋，共獲得有效注釋信息基因173個(gè)，基因功能分類結(jié)果表明，功能未知的假定蛋白所

8、占比例最高，約占總數(shù)10％;參與脂類代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，編碼蛋白激酶和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)基因所占比例次之，都約占9％;參與蛋白質(zhì)代謝、ABA代謝基因約占總數(shù)的6％;與光合作用、碳水化合物代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)的基因分別約占5％;其它差異表達(dá)基因參與的功能還有呼吸作用、轉(zhuǎn)錄因子、激素代謝、氧化脅迫、氮代謝、細(xì)胞代謝等。實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)表明芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果是可靠和可重復(fù)的。
　　 4.以芯片實(shí)驗(yàn)基因篩選結(jié)果為參考，應(yīng)用RCAE技術(shù)擴(kuò)增出與水稻中

9、非酵解型蛋白激酶基因SAPK3同源性極高的甘蔗基因全長cDNA并命名為SoSnRK2.1。序列分析表明，該基因全長cDNA為1385 bp，開放閱讀框長為1002 bp，編碼333個(gè)氨基酸，并與其它物種SnRK2基因具有很高同源性，聚類分析顯示該基因?qū)儆赟nRK2家族第一亞家族。預(yù)測SoSnRK2.1分子量為37.8 kDa，等電點(diǎn)為5.54，是親水性非跨膜蛋白質(zhì)，在第5-261位氨基酸之間存在蛋白激酶保守催化域，分別具有11、3和8個(gè)