偽狂犬病毒沿神經(jīng)元細(xì)胞軸突運(yùn)輸?shù)某醪窖芯?pdf

1、偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）屬于α皰疹病毒亞科，具有嗜神經(jīng)性，能夠侵染宿主后在外周神經(jīng)系統(tǒng)建立潛伏感染，使宿主終生帶毒。PRV病毒粒子由內(nèi)到外分為雙鏈DNA、衣殼、被膜蛋白、囊膜蛋白四層，其中被膜蛋白又分為內(nèi)層被膜蛋白和外層被膜蛋白，內(nèi)層被膜蛋白一般與核衣殼連接，外層被膜蛋白一般與膜蛋白的胞漿區(qū)相連接。病毒侵入神經(jīng)元的過程與侵染大多數(shù)培養(yǎng)的傳代細(xì)胞的過程很相似。首先，在外周神經(jīng)系統(tǒng)的軸突末端病毒的囊膜蛋白與

2、細(xì)胞膜融合，然后核衣殼沿著軸突微管逆行運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞體的細(xì)胞核。同時(shí)內(nèi)層被膜蛋白(UL36、UL37)和US3也能隨核衣殼逆行運(yùn)輸至細(xì)胞核。但是，病毒粒子由神經(jīng)元細(xì)胞體沿軸突順行運(yùn)輸至軸突遠(yuǎn)端的機(jī)制存在很大爭議，一些學(xué)者認(rèn)為病毒在神經(jīng)元細(xì)胞體完成組裝形成成熟病毒粒子沿軸突運(yùn)輸至軸突末端釋放，另一部分學(xué)者認(rèn)為病毒的核衣殼和囊膜蛋白分別沿軸突運(yùn)輸至軸突末端，然后在軸突末端完成組裝釋放。
　　 最近發(fā)現(xiàn)在海馬神經(jīng)元的軸突起始段(axon

3、initial segment，AIS)的胞漿中存在一個(gè)由肌動(dòng)蛋白和錨定蛋白G構(gòu)成的“分子篩”(the cytoplasmic filter)，像濾網(wǎng)一樣阻止一些大分子物質(zhì)(70KD)在軸突和胞體之間的擴(kuò)散，但可允許小分子物質(zhì)(10KD)和某些依賴特定馬達(dá)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的膜蛋白通過，膜蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)與馬達(dá)蛋白的驅(qū)動(dòng)力強(qiáng)弱和膜蛋白-馬達(dá)蛋白復(fù)合體的運(yùn)輸效能有關(guān)。那么PRV沿軸突逆行運(yùn)輸過程中，病毒蛋白進(jìn)入細(xì)胞體是否也受到神經(jīng)元“分子篩”的影響？

4、r>　　 根據(jù)以上研究背景，本試驗(yàn)首先構(gòu)建PRV gB-RFP、PRV VP16-EGFP、PRVEGFP-VP1/2、PRV EGFP-VP26四個(gè)重組示蹤病毒，觀察示蹤病毒在軸突中的運(yùn)輸情況。然后在微流體系統(tǒng)(microfluidic chamber system)中體外原代培養(yǎng)雞胚的脊髓背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，在軸突端接種示蹤病毒共聚焦顯微鏡下觀察病毒進(jìn)入細(xì)胞體的情況。主要工作包括:
　　 1.示蹤病毒的構(gòu)建
　　 計(jì)劃

5、在PRV的囊膜蛋白gB(UL27)、外層被膜蛋白VP16(UL48)、內(nèi)層被膜蛋白VP1/2(UL36)、衣殼蛋白VP26(UL35)的C端或N端插入熒光標(biāo)記基因EGFP或RFP構(gòu)建構(gòu)建PRV gB-RFP、PRV VP16-EGFP、PRV EGFP-VP1/2、PRV EGFP-VP26重組示蹤病毒。首先以PRV Ea株的野毒基因組為模板分別擴(kuò)增UL27、UL48、UL36、UL35基因的上下游同源臂，同時(shí)分別以pEGFP-C1和p

6、RFP-C1質(zhì)粒為模板擴(kuò)增EGFP和RFP，依次連入pcDNA3.1中構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。然后與PRV的野毒基因組通過脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染的方法獲得重組病毒，通過幾輪篩選和純化獲得純的示蹤病毒。然后通過空斑大小和一步法生長曲線比較幾種重組毒與野毒的增殖特性，發(fā)現(xiàn)示蹤病毒所形成的空斑要明顯小于野毒形成的，但是增殖曲線沒有區(qū)別。
　　 2.雞胚脊髓背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的原代培養(yǎng)
　　 選取8-12日齡的雞胚，在解剖顯微鏡下獲取脊髓背根神經(jīng)節(jié)

7、(DRG)，直接接種在DMEM無血清培養(yǎng)液(NGF2.5S，20ng/mL)中進(jìn)行外植體培養(yǎng)，培養(yǎng)7-10天左右進(jìn)行觀察。同樣方法在獲得脊髓背根神經(jīng)節(jié)后用0.125％的胰酶消化成單個(gè)的細(xì)胞，先接種在種植培養(yǎng)液中，24h后更換成飼養(yǎng)培養(yǎng)液，在第3天用阿糖胞苷處理抑制非神經(jīng)細(xì)胞的增殖，作用48 h后更換新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液，培養(yǎng)7-10天左右進(jìn)行觀察。通過間接免疫熒光驗(yàn)證所培養(yǎng)的細(xì)胞確實(shí)是雞胚脊髓背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。接種重組示蹤病毒觀察病毒在神經(jīng)細(xì)胞

8、軸突中運(yùn)輸?shù)那闆r，發(fā)現(xiàn)病毒的蛋白沿軸突運(yùn)輸，其運(yùn)輸方向是雙向的，并且呈跳躍式運(yùn)輸。
　　 3.微流體系統(tǒng)的建立
　　 利用微流體系統(tǒng)(microfluidic chamber system)進(jìn)行原代培養(yǎng)雞胚脊髓背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，神經(jīng)元細(xì)胞種植在一個(gè)隔間（S室）中，軸突通過細(xì)微紋溝延伸到另一隔間（N室）中。DRG細(xì)胞在S室中培養(yǎng)5天后即可通過細(xì)微紋管進(jìn)入N室。在N室中接種示蹤病毒PRV VP16-EGFP2h后，在激光共聚焦