棉鈴蟲EcR、USP和FTZ-F1表達(dá)規(guī)律以及功能研究.pdf

1、完全變態(tài)昆蟲要經(jīng)過周期性的蛻皮和變態(tài)才能完成整個生活史，昆蟲發(fā)育的生理活動是在一系列激素的調(diào)控下完成的。通過對昆蟲蛻皮相關(guān)基因的研究，不僅可以了解昆蟲的生長發(fā)育以及蛻皮的分子機理，而且在此基礎(chǔ)上可以發(fā)現(xiàn)新的分子靶標(biāo)，為害蟲防治提供新思路。昆蟲蛻皮激素受體(ecdysonereceptor，EcR)和超氣門蛋白(ultraspiracle，USP)是蛻皮激素的分子靶標(biāo)，處于昆蟲蛻皮、變態(tài)及繁殖等生命過程級聯(lián)反應(yīng)的啟動位置，對昆蟲的生長、發(fā)

2、育及繁殖具有重要的意義。本文利用RNAi技術(shù)以及實時定量PCR技術(shù)研究了EcR和USP基因在棉鈴蟲五齡、六齡幼蟲的表達(dá)規(guī)律及其功能，并且研究了EcR和USP基因分別沉默后，對E74、JHE、HR3、FTZ-F1等蛻皮相關(guān)基因的影響，以確定這些基因之間的上下游關(guān)系。FTZ-F1是與果蠅同源異形蛋白FTZ(fushitarazu)以異二聚體形式發(fā)揮作用，F(xiàn)TZ-F1參與幼蟲到幼蟲的蛻皮、幼蟲的化蛹以及成蟲的發(fā)育過程。本文首次克隆了βFTZ-

3、F1的中間片段，并利用實時定量PCR技術(shù)研究了該基因在棉鈴蟲五齡、六齡幼蟲中的表達(dá)規(guī)律，利用RNAi技術(shù)研究了該基因的功能，以及FTZ-F1基因與EcR、USP、E74、JHE、HR3之間的相關(guān)關(guān)系。
　　實時定量PCR分析EcR、USP、E74、JHE、HR3、FTZ-F1的mRNA在棉鈴蟲五齡、六齡中的表達(dá)規(guī)律，結(jié)果表明這六個蛻皮相關(guān)基因在棉鈴蟲的五齡、六齡均有表達(dá)，呈現(xiàn)周期性變化。其中EcR與USPmRNA均在五齡期出現(xiàn)一個

4、表達(dá)峰，六齡期出現(xiàn)兩個表達(dá)峰，根據(jù)二者的表達(dá)峰出現(xiàn)的時間，發(fā)現(xiàn)EcR相對USP表達(dá)超前8-16h;E74在五齡與六齡期分別出現(xiàn)一個表達(dá)峰;JHE與HR3均是在五齡期出現(xiàn)一個表達(dá)峰、六齡期出現(xiàn)兩個表達(dá)峰;FTZ-F1在五齡與六齡期均出現(xiàn)兩個表達(dá)峰。根據(jù)各個基因的表達(dá)水平以及表達(dá)峰出現(xiàn)的時間，可以得出:EcR、USP、E74、HR3、FTZ-F1參與了昆蟲幼蟲間的蛻皮、預(yù)蛹的形成以及預(yù)蛹-蛹的發(fā)育，JHE參與了昆蟲幼蟲間的蛻皮以及預(yù)蛹-蛹的

5、發(fā)育。
　　EcR與USP分別沉默后，發(fā)現(xiàn)其導(dǎo)致靶標(biāo)基因表達(dá)下調(diào)的同時，也對其他蛻皮相關(guān)基因的表達(dá)造成一定的影響。EcR的下調(diào)，導(dǎo)致了E74、JHE、HR3、FTZ-F1基因一定程度的下調(diào)，說明EcR處于E74、JHE、HR3、FTZ-F1的上游，參與E74、JHE、HR3、FTZ-F1的表達(dá);USP的下調(diào)，也導(dǎo)致了E74、JHE、HR3、FTZ-F1基因一定程度的下調(diào)，說明USP處于E74、JHE、HR3、FTZ-F1的上游，參

6、與E74、JHE、HR3、FTZ-F1的表達(dá)。FTZ-F1沉默后，導(dǎo)致了FTZ-F1基因表達(dá)的下調(diào)，同時也對HR3的表達(dá)造成一定的影響，HR3的表達(dá)呈現(xiàn)上升與下降的交替變化，已有文獻(xiàn)報道HR3參與了FTZ-F1的表達(dá)，而FTZ-F1的下調(diào)對HR3造成一定的影響，我們推測，F(xiàn)TZ-F1與HR3二者存在相關(guān)抑制的現(xiàn)象。
　　利用RNAi研究EcR、USP與FTZ-F1的功能。將EcR沉默后，處理的五齡幼蟲出現(xiàn)不能正常蛻皮進入六齡的異常

7、表型，呈現(xiàn)蛻皮停滯狀態(tài);處理的六齡幼蟲出現(xiàn)三種異常表型，不能正常形成預(yù)蛹、不能正?；家约俺霈F(xiàn)發(fā)育缺陷型蛹，說明EcR參與昆蟲幼蟲間的蛻皮、預(yù)蛹的形成以及預(yù)蛹-蛹的發(fā)育。將USP沉默后，出現(xiàn)與EcR的沉默相類似的異常表型，處理的五齡幼蟲出現(xiàn)不能正常蛻皮進入六齡的異常表型，呈現(xiàn)蛻皮停滯狀態(tài);處理的六齡幼蟲不能正常形成預(yù)蛹、不能正?；?，說明USP在昆蟲幼蟲間的蛻皮、預(yù)蛹的形成以及預(yù)蛹-蛹的發(fā)育等過程是必需的。將EcR與USP同時沉默后，產(chǎn)