菊花CmeIF4E、CmeIF(iso)4E基因的克隆、表達分析及其與菊花B病毒外殼蛋白的互作研究.pdf

1、菊花(Chrysanthemum xmorifolium)為菊科菊屬多年生宿根草本植物，具有很高的觀賞和經濟價值。菊花栽培品種生產上主要依靠扦插繁殖，非常有利于病毒病的積累和傳播，極大地降低了菊花的品質和經濟價值。國內外已報道的能夠侵染菊花的病毒有20多種，我國已報道的有8種，其中菊花B病毒(Chrysanthemum B Virus，CVB)已成為侵染危害菊花的優(yōu)勢病毒。研究發(fā)現(xiàn)，真核翻譯起始因子4E(eukaryotictransl

2、ation initiation factor4E，eIF4E)是翻譯起始因子eIF4F的一個亞單位，是mRNA翻譯中最有效的限速調節(jié)因子。eIF4E除了在植物的基因表達調控中起重要作用，eIF4E還是RNA病毒增殖不可缺少的敏感性因子，在植物病毒侵染過程中起關鍵作用。所以，通過分子生物學的手段突變eIF4E能影響病毒-植物的互作，從而有效的阻斷病毒的侵染，而且利用植物自身基因所獲得的抗性具有一定的廣譜性。菊花中翻譯起始因子4E基因的研

3、究還未見報道，因此，本研究以CVB和菊花CmeIF4E、CmeIF(iso)4E為研究對象，針對其致病機制以及植物所對應的抗病性開展研究。本文從菊花中分離克隆出菊花CmeIF4E、CmeIF(iso)4E基因，分析其表達特性，并研究了其與CVB CP的互作關系。為翻譯起始因子4E在植物自身表達調控及其病毒侵染等方面的研究提供一定的理論基礎。主要研究結果如下:
　　 1.同源克隆法克隆到菊花eIF4E、eIF(iso)4E基因的c

4、DNA全長序列，分別命名為CmeIF4E(Genbank登錄號為JQ904591)和CmeIF(iso)4E(Genbank登錄號為JQ904592)。序列分析顯示，這2個基因均具有兩個IF4E家族結構域，為典型的翻譯起始因子4E基因。CmeIF4E基因全長914 bp，654 bp ORF編碼218個氨基酸，推導的氨基酸序列與萵苣同源性最高為79％，其中，在蛋白質翻譯起始過程中與eIF4G和mRNA帽子結構結合的位點，具有高度的保守性

5、。CmeIF(iso)4E基因全長818 bp，573bp ORF編碼191個氨基酸，推導的氨基酸序列與萵苣同源性為90％。CmeIF4E和CmeIF(iso)4E兩者氨基酸序列相似度為45.66％。
　　 2.熒光定量PCR結果表明，CmeIF4E和CmeIF(iso)4E基因在切花菊‘神馬’的根、莖、葉、管狀花、舌狀花都有表達，CmeIF4E的轉錄由高到低依次是根、葉、管狀花、莖、舌狀花，CmeIF(iso)4E的表達水平由

6、高到低依次是根、管狀花、舌狀花、葉、莖。
　　 3.構建綠色熒光蛋白融合表達載體，基因槍法轉化洋蔥表皮細胞進行瞬時表達，結果表明，菊花CmeIF4E和CmeIF(iso)4E蛋白在細胞核，細胞質，細胞膜都有分布。
　　 4.構建酵母表達載體pGBKT7-CVBCP以及pGADT7-CmeIF4E和pGADT7-CmeIF(iso)4E，利用酵母雙雜交系統(tǒng)證明了CmeIF(iso)4E與CVBCP存在蛋白間的互作;進一步采

7、用雙分子熒光互補技術驗證CmeIF(iso)4E與CVBCP蛋白的互作，結果表明，CmeIF(iso)4E與CVBCP在細胞核、細胞質、細胞膜均有互作。
　　 5.采用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選切花菊‘神馬’文庫中與菊花B病毒外殼蛋白以及CmeIF4E、CmeIF(iso)4E互作的蛋白。初步得到了與CVB外殼蛋白相互作用的E3泛素連接酶ARIADNE-like蛋白和ATP結合蛋白。篩選得到與CmeIF4E及其異構體CmeIF(iso)