轉(zhuǎn)哺乳動物cyp2el基因煙草植株再生及其分析.pdf

1、哺乳動物肝細(xì)胞中cyp2el基因所編碼的蛋白CYP2E1在代謝異型有機物方面起著重要作用，轉(zhuǎn)cyp2e1基因植物能夠高效分解苯、甲苯、三氯乙烯、三氯甲烷、四氯化碳和二氯乙烯等有機污染物。在哺乳動物體內(nèi)，CYP2E1酶受到乙醇、異丙醇、丙酮、乙醚、苯、甲苯、甲醛、吡唑和異煙肼等因子的誘導(dǎo)；缺氧等環(huán)境因素也可以誘導(dǎo)cyp2e1基因的表達(dá)；而且，從代謝途徑看，在CYP2E1酶對異型有機物的代謝過程中，NADPH-P450氧化還原酶和細(xì)胞色素(

2、cytochrome)b5參與CYP2E1酶催化過程的電子傳遞鏈，但cyp2e1基因在轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)的表達(dá)調(diào)控和代謝機理尚不清楚。本研究首先利用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功地將cyp2el基因轉(zhuǎn)入煙草，分析了外源基因cyp2e1在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)以及外源基因在后代中的分離情況，同時分析了不同環(huán)境因子對cyp2e1表達(dá)的影響以及轉(zhuǎn)基因煙草內(nèi)源性NADPH-P450氧化還原酶和細(xì)胞色素b5的表達(dá)情況。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.將含

3、有cyp2e1基因的質(zhì)粒pSLD50-6和對照gus基因的質(zhì)粒pKH200轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)基因技術(shù)將cyp2e1基因和對照gus基因轉(zhuǎn)入煙草，分別獲得轉(zhuǎn)cyp2e1和gus基因煙草再生植株。經(jīng)PCR、RT-PCR、熒光定量PCR(qRT-PCR)及Western Blot檢測表明，cyp2e1基因成功轉(zhuǎn)入煙草，并在煙草中高效表達(dá)。
　　 2.外源基因cyp2e1在隨機選取的TL01、TL03和TL263個

4、株系轉(zhuǎn)基因煙草后代中出現(xiàn)了分離，其分離比分別是51∶9、48∶12和34∶26，均不符合3:1的比例，表明外源基因以多拷貝方式插入煙草基因組中。qRT-PCR分析結(jié)果顯示，外源基因cyp2e1在轉(zhuǎn)基因煙草各器官中均能表達(dá)，但表達(dá)量有一定差異，葉＞根＞莖＞花。此外，在轉(zhuǎn)cyp2e1基因再生植株中觀察到花器官的變異。
　　 3.在分析瓶中，將轉(zhuǎn)cyp2e1基因煙草培養(yǎng)分別在含甲醛50μg/mL、乙醇8mg/mL、丙酮8mg/mL、苯

5、8μg/mL、甲苯8μg/mL的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7d，同時將轉(zhuǎn)基因煙草浸沒在無菌水中進(jìn)行缺氧處理（水淹）12h，qRT-PCR分析cyp2e1基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)情況；結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)錄水平上，轉(zhuǎn)cyp2e1基因煙草中，乙醇處理后cyp2e1基因的表達(dá)明顯下降，苯和甲苯處理后cyp2e1基因的表達(dá)量稍有下降；而丙酮、甲醛處理和缺氧條件下cyp2e1基因的表達(dá)有不同程度的升高。
　　 4.qRT-PCR分析煙草內(nèi)源性NADPH-P4

6、50氧化還原酶基因和細(xì)胞色素b5基因在野生型煙草、轉(zhuǎn)gus煙草和轉(zhuǎn)cyp2e1煙草中的表達(dá)，以及經(jīng)過苯處理后的NADPH-P450氧化還原酶基因和細(xì)胞色素b5基因的表達(dá)情況。結(jié)果是：煙草內(nèi)源性NADPH-P450氧化還原酶基因和細(xì)胞色素b5基因在野生型煙草、轉(zhuǎn)gus煙草和轉(zhuǎn)cyp2e1煙草中表達(dá)量沒有明顯差異；但經(jīng)過苯處理后，轉(zhuǎn)cyp2e1基因煙草中NADPH-P450氧化還原酶和細(xì)胞色素b5酶的基因活性顯著提高，說明煙草中NADPH-