茶樹L組UDPG-糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及原核表達(dá).pdf

1、兒茶素是茶樹重要次生代謝產(chǎn)物茶多酚的主體組分，也是決定茶葉品質(zhì)的主要化學(xué)成分。研究茶兒茶素合成途徑中關(guān)鍵基因的功能，對(duì)茶樹良種選育、茶葉品質(zhì)調(diào)控具有重要意義。
　　 類黃酮合成途徑已基本明了，推測(cè)UDPG-糖基轉(zhuǎn)移酶(UGGT)是合成βG的直接酶類。本論文利用FULL-RACE、qRT-PCR、原核表達(dá)、HPLC技術(shù)，對(duì)基因庫(kù)中三條UGT基因進(jìn)行全長(zhǎng)克隆及生物信息學(xué)分析、實(shí)時(shí)熒光定量分析、目的蛋白的原核表達(dá)、蛋白酶活性檢測(cè)、反應(yīng)

2、產(chǎn)物鑒定等。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 1.通過(guò)FULL-RACE技術(shù)克隆了CsUGT75E1、CsUGT75E2和CsUGT75E3的ORF序列，使用DNAMAN軟件、ClustalX、NCBI軟件、TMHMM、SignalP、PredictProtein、ScratchproteinPredictor網(wǎng)站軟件，對(duì)三個(gè)基因的序列進(jìn)行了比對(duì)，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，三個(gè)CsUGTS蛋白的氨基酸序列一致

3、性為68.53％，在N端均沒(méi)有信號(hào)肽序列，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的元件數(shù)量和分布都非常相似，分別具有2個(gè)、4個(gè)、2個(gè)二硫鍵。
　　 2.通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究了CsUGT75E1、CsUGT75E2和CsUGT75E3基因在茶樹葉片不同發(fā)育階段、不同誘導(dǎo)處理、黃化苗去黃化過(guò)程中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)趨勢(shì)差異不大；三個(gè)CsUGTs相對(duì)表達(dá)量在芽中最高；脫落酸(ABA)、赤霉素和傷害處理1h后，CsUGT75E1、CsUGT

4、75E2相對(duì)表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組明顯降低。而激素和傷害處理48h后，CsUGT75E3的相對(duì)表達(dá)量明顯較低。黃化苗去黃化過(guò)程中三個(gè)CsUGTs相對(duì)表達(dá)量在莖中均呈下降趨勢(shì)，而CsUGT75E2和CsUGT75E3相對(duì)表達(dá)量在葉中呈先上升后下降的趨勢(shì)。
　　 3.利用構(gòu)建pET28a-CsUGT75E1、pET28a-CsUGT75E2、pET32a-CsUGT75E1、pETSUMO-CsUGT75E1andpETSUMO-CsU

5、GT75E3重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化了表達(dá)宿主菌rosetta(DE3)，并用IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)，pET28a-CsUGT75E1、pET28a-CsUGT75E2和pET32a-CsUGT75E1均以包涵體存在；pETSUMO-CsUGT75E1andpETSUMO-CsUGT75E3用IPTG誘導(dǎo)，超聲破碎后在上清中有表達(dá)。
　　 4.使用親和樹脂對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)生的融合蛋白進(jìn)行純化，以GA、UDPG作為底物，對(duì)CsUGT75E1、C