茶樹L組UDPG-糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及原核表達.pdf

1、兒茶素是茶樹重要次生代謝產(chǎn)物茶多酚的主體組分，也是決定茶葉品質(zhì)的主要化學(xué)成分。研究茶兒茶素合成途徑中關(guān)鍵基因的功能，對茶樹良種選育、茶葉品質(zhì)調(diào)控具有重要意義。
　　 類黃酮合成途徑已基本明了，推測UDPG-糖基轉(zhuǎn)移酶(UGGT)是合成βG的直接酶類。本論文利用FULL-RACE、qRT-PCR、原核表達、HPLC技術(shù)，對基因庫中三條UGT基因進行全長克隆及生物信息學(xué)分析、實時熒光定量分析、目的蛋白的原核表達、蛋白酶活性檢測、反應(yīng)

2、產(chǎn)物鑒定等。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 1.通過FULL-RACE技術(shù)克隆了CsUGT75E1、CsUGT75E2和CsUGT75E3的ORF序列，使用DNAMAN軟件、ClustalX、NCBI軟件、TMHMM、SignalP、PredictProtein、ScratchproteinPredictor網(wǎng)站軟件，對三個基因的序列進行了比對，預(yù)測蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，三個CsUGTS蛋白的氨基酸序列一致

3、性為68.53％，在N端均沒有信號肽序列，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的元件數(shù)量和分布都非常相似，分別具有2個、4個、2個二硫鍵。
　　 2.通過實時熒光定量PCR技術(shù)研究了CsUGT75E1、CsUGT75E2和CsUGT75E3基因在茶樹葉片不同發(fā)育階段、不同誘導(dǎo)處理、黃化苗去黃化過程中的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們的表達趨勢差異不大；三個CsUGTs相對表達量在芽中最高；脫落酸(ABA)、赤霉素和傷害處理1h后，CsUGT75E1、CsUGT

4、75E2相對表達量相對于對照組明顯降低。而激素和傷害處理48h后，CsUGT75E3的相對表達量明顯較低。黃化苗去黃化過程中三個CsUGTs相對表達量在莖中均呈下降趨勢，而CsUGT75E2和CsUGT75E3相對表達量在葉中呈先上升后下降的趨勢。
　　 3.利用構(gòu)建pET28a-CsUGT75E1、pET28a-CsUGT75E2、pET32a-CsUGT75E1、pETSUMO-CsUGT75E1andpETSUMO-CsU

5、GT75E3重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化了表達宿主菌rosetta(DE3)，并用IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達，pET28a-CsUGT75E1、pET28a-CsUGT75E2和pET32a-CsUGT75E1均以包涵體存在；pETSUMO-CsUGT75E1andpETSUMO-CsUGT75E3用IPTG誘導(dǎo)，超聲破碎后在上清中有表達。
　　 4.使用親和樹脂對誘導(dǎo)產(chǎn)生的融合蛋白進行純化，以GA、UDPG作為底物，對CsUGT75E1、C