乳腺特異表達(dá)嗜熱菌糖苷酶轉(zhuǎn)基因牛的研究.pdf

1、轉(zhuǎn)基因動物研究已經(jīng)成為生命科學(xué)研究和開發(fā)的重要領(lǐng)域，也是發(fā)展新型畜牧業(yè)的有效途徑之一。本研究旨在將嗜熱菌糖苷酶(LacS)基因通過轉(zhuǎn)基因手段整合到奶?；蚪M，并通過構(gòu)建乳腺特異表達(dá)載體使其在轉(zhuǎn)基因個體的乳腺中表達(dá)，以期降低牛奶中乳糖比例。
　　1.通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）從 pEGFP-Cl中得到啟動子 CMV并在其兩端引入SacI和KpnI兩個酶切位點，將其插入線性化載體pDsRed2-1紅色熒光蛋白基因上游，指導(dǎo)該基因在真

2、核生物中的表達(dá)，得到質(zhì)粒 pDsRed-CMV；將來自古細(xì)菌-硫礦硫化葉菌的β-乳糖糖苷酶基因（LacS）中的374個位點進行偏好性調(diào)整，用化學(xué)合成法獲得優(yōu)化后的LacS基因片段及以奶牛血液基因組為模板PCR得到的poly（A）加尾序列連入載體pDsRed-CMV的MCS中，得到載體pDsRed-CPL；最后，以奶牛血液基因組DNA為模板PCR擴增得到酪蛋白（BC）啟動子片段，并在其兩端引入Xho I和Sal I兩個酶切位點，將其插入線

3、性化載體pDsRed-CPL的LacS基因的上游，得到質(zhì)粒pBL，構(gòu)建乳腺特異性表達(dá)載體。經(jīng)酶切和PCR鑒定，質(zhì)粒構(gòu)建正確。
　　2.采集牛胎兒皮膚組織，用組織塊法分離培養(yǎng)牛胎兒皮膚成纖維細(xì)胞。對來源于經(jīng)鑒定為雌性的牛胎兒的皮膚分離培養(yǎng)得到的原代成纖維細(xì)胞進行冷凍保存。共建立10個雌性牛胎兒皮膚成纖維細(xì)胞系，從中選擇3個原代細(xì)胞游離快、形態(tài)良好且生長正常的皮膚成纖維細(xì)胞，測定生長曲線和核型分析。結(jié)果表明：選擇的三個細(xì)胞系的F5代、

4、F10代和F15代細(xì)胞生長均經(jīng)歷了潛伏期0-2天、對數(shù)生長期3-6天和平臺期7天之后；三個細(xì)胞系F5代、F10代和F15代細(xì)胞染色體具有正常二倍體性的比率（正常染色體數(shù)目：2N=60）均在80％以上。說明這三個細(xì)胞系F15代之前均可作為核移植的供體細(xì)胞。
　　3.經(jīng)測序鑒定正確的質(zhì)粒（DS-Red-LacS2），采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染已選擇的3個牛胎兒成纖維細(xì)胞。轉(zhuǎn)染18-24h后能夠表達(dá)紅色熒光的轉(zhuǎn)染組合以1：30稀釋培養(yǎng)

5、，細(xì)胞生長匯合達(dá)50%-70%時，換為含600μg/ml G418的篩選培養(yǎng)液培養(yǎng)直至形成單克隆。將能夠表達(dá)紅色熒光的克隆混合擴大培養(yǎng)，并做目的基因檢測。結(jié)果表明，能夠表達(dá)紅色熒光的混合克隆均能夠檢測到目的基因，因而篩選得到的混合克隆可以作為核移植的供體細(xì)胞。
　　4.采用體細(xì)胞核移植法構(gòu)建轉(zhuǎn) LacS基因重構(gòu)胚胎。經(jīng)卵母細(xì)胞孤雌發(fā)育體系摸索，確定了轉(zhuǎn)基因重構(gòu)胚體外培養(yǎng)和發(fā)育的參數(shù)。結(jié)果表明，構(gòu)建牛克隆胚胎過程中融合參數(shù)以電壓10

6、0v、脈沖時間30μs和脈沖次數(shù)2次最佳，融合率達(dá)到78%-80%；激活采用離子酶素聯(lián)合6-D的方法最佳，卵裂率達(dá)90%以上，囊胚率達(dá)30%以上。
　　5.采用非手術(shù)法進行轉(zhuǎn) LacS基因克隆胚胎移植。選擇緊縮桑葚胚、早期囊胚和囊胚移植到同期發(fā)情的受體母牛子宮，60天妊娠檢查結(jié)果，來源于2個不同細(xì)胞系作為核供體構(gòu)建的重構(gòu)胚移植后有受體牛妊娠，其中來源于P06.17的細(xì)胞作為核供體的胚胎妊娠比例相對較高，且能夠順利產(chǎn)下新生小牛。采集