J亞群禽白血病病毒和禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒單克隆抗體的研制.pdf

1、禽白血病和網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥均可引起禽類(lèi)腫瘤和免疫抑制性疾病。這兩種禽腫瘤病都可導(dǎo)致不同程度的二重感染、多重感染及繼發(fā)感染，減弱雞群對(duì)各種疫苗的應(yīng)答能力，加劇某些疾病的臨床表現(xiàn)。目前，對(duì)禽白血病和禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥尚無(wú)有效的藥物治療，也沒(méi)有疫苗可以進(jìn)行預(yù)防，世界各國(guó)主要通過(guò)抗原/抗體檢測(cè)，淘汰陽(yáng)性雞，凈化種群等防制措施來(lái)控制這兩種禽腫瘤病。ALV-J gp85基因編碼的表面蛋白（SU）是病毒囊膜蛋白的重要組成成分，有許多病毒抗原位點(diǎn)，

2、也是亞群區(qū)分的主要蛋白，是檢測(cè)亞群特異性抗體的首選抗原。REV env基因編碼SU和跨膜蛋白（TM）。本課題分別以ALV-J中國(guó)株WS0705 和REV原型株SNV株為標(biāo)準(zhǔn)株，選取了1200bp相對(duì)保守的env基因序列，包涵該段基因表達(dá)REV病毒90％以上的抗原位點(diǎn)，既保證了基因的保守性又保留了良好的抗原性。
　　 本研究將含有ALV-J gp85基因重組質(zhì)粒pProExHTB-gp85轉(zhuǎn)化入BL21宿主菌，將含有REV env

3、基因的重組質(zhì)粒pET-28a-env轉(zhuǎn)化入BL21（DE3）宿主菌，分別優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳，分別在在35KD處和45KD處出現(xiàn)目的蛋白。采用尿素法純化大量表達(dá)的蛋白包涵體，通過(guò)透析法恢復(fù)蛋白的天然構(gòu)象和蛋白活性。測(cè)定純化蛋白濃度后進(jìn)行ELISA和Western-blot檢測(cè)，結(jié)果顯示ELISA檢測(cè)靈敏性能達(dá)到100ng/mL，表達(dá)的兩種蛋白都具有良好的靈敏性和特異性。以純化的His-gp85蛋白和His

4、-env蛋白為抗原免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，免疫劑量為300μg/只，免疫3次采后通過(guò)ELISA和IFA試驗(yàn)測(cè)定了所獲得的多抗效價(jià)，ELISA測(cè)得效價(jià)分別達(dá)到1：100萬(wàn)和1:200萬(wàn)，IFA測(cè)得效價(jià)分別高于1:3200和1:12800。以純化的His-gp85蛋白和His-env蛋白為抗原免疫6周齡的Balb/c純系小鼠,40μg/只，免疫3次，采血，建立間接ELISA方法和IFA法測(cè)定血清抗體效價(jià)。取血清效價(jià)高的Balb/c小

5、鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在PEG1500的作用下進(jìn)行細(xì)胞融合。用HAT選擇培養(yǎng)基對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)雜交瘤細(xì)胞集落布滿(mǎn)孔底1/4-1/2時(shí)，取細(xì)胞上清作抗體效價(jià)檢測(cè)。采用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性孔進(jìn)行亞克隆，重復(fù)3次以上，直到取得能穩(wěn)定分泌抗體的單克隆細(xì)胞株。得到抗ALV-J病毒單克隆細(xì)胞兩株分別命名為1D3和3B1，ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清抗體效價(jià)均為1:1024；得到抗REV病毒單克隆細(xì)胞株一株命名為4D5，ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清效