加拿大草原地區(qū)不同土壤類型的叢枝菌根真菌(AMF)遺傳多樣性研究.pdf

1、叢枝菌根真菌(arbuscularmycorrhizalfungi，AMF)是土壤中廣泛分布并能與絕大部分維管束植物根系形成互利共生的關(guān)系，因此成為自然生態(tài)系統(tǒng)中重要的組成部分。AMF對(duì)宿主植物優(yōu)良的共生效益是人們研究它的主要興趣所在，希望掌握AMF對(duì)宿主植物的促生效應(yīng)達(dá)到合理和有效利用菌根資源的目的。然而AMF是一種活體共生真菌，只有在生活的植物根系中才能完成生活史，目前AMF純培養(yǎng)一直是未能解決，致使人們對(duì)它的生理生化代謝，遺傳學(xué)，

2、尤其是其自然資源多樣性的了解十分有限。目前新發(fā)展的第二代測(cè)序技術(shù)(thenextgenerationsequencing)如焦磷酸測(cè)序技術(shù)，較傳統(tǒng)的克隆和測(cè)序方法具有更加高效、準(zhǔn)確和高信息量的優(yōu)勢(shì)。但巢式PCR由于其較多的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，并不適合以焦磷酸測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的方法。因?yàn)橄鄬?duì)增多的假陽(yáng)性序列比例會(huì)產(chǎn)生更多的假陽(yáng)性測(cè)序結(jié)果，將強(qiáng)烈影響到最后對(duì)AMF物種豐富度和多樣性的測(cè)算和估計(jì)。
　　 本論文通過(guò)測(cè)試不同的目的基因擴(kuò)增方法，優(yōu)化P

3、CR擴(kuò)增體系和目的產(chǎn)物純化體系，探索出適合從土壤總DNA中擴(kuò)增AMF目的基因并用于焦磷酸測(cè)序的方案?，F(xiàn)對(duì)各部分實(shí)驗(yàn)進(jìn)行如下總結(jié)和概括：
　　 1.不同DNA樣品處理方法對(duì)焦磷酸測(cè)序結(jié)果的影響。首先設(shè)計(jì)該實(shí)驗(yàn)方案，分別比較巢式PCR和單一PCR擴(kuò)增DNA樣品后對(duì)焦磷酸測(cè)序結(jié)果的不同影響，并利用PCR產(chǎn)物純化試劑盒代替?zhèn)鹘y(tǒng)的凝膠電泳分離產(chǎn)物，切膠提純的方法，以期找到適合焦磷酸測(cè)序的擴(kuò)增DNA樣品的最優(yōu)方案。該實(shí)驗(yàn)10個(gè)土壤樣品分別來(lái)

4、自不同小麥大田，首先從土壤中提取總DNA，再用AMF特異引物擴(kuò)增AMF目的基因-核糖體小亞基(18SrDNA)，該基因結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖如下：
　　 我們?cè)O(shè)計(jì)了三種方法來(lái)擴(kuò)增原始DNA和純化目的產(chǎn)物。方法一，巢式PCR擴(kuò)增目的基因(先用真菌通用引物擴(kuò)增土壤中的所有真菌18SrDNA基因，再用AMF特異引物擴(kuò)增AMF的18SrDNA基因)，凝膠電泳分離并純化目的DNA片段。方法二，單一PCR并重復(fù)三次擴(kuò)增目的基因，凝膠電泳分離并純化目的DN

5、A片段。方法三，單一PCR并重復(fù)三次擴(kuò)增目的基因，PCR純化試劑盒通過(guò)電荷交換原理直接純化目的DNA片段。三種方法處理的10個(gè)DNA樣品同時(shí)送樣進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示：在97％相似度水平上，方法一共獲得1319條有效序列，其中209條是AMF序列，產(chǎn)生25個(gè)AMF分子分類單位(OTU)；方法二共獲得7222條有效序列，其中931條屬于AMF，產(chǎn)生89個(gè)OTU；方法三獲得80875條有效序列，14736屬于AMF，產(chǎn)生410個(gè)OTU

6、，且方法一和方法二中大多數(shù)產(chǎn)生的OTU都包括在方法三中。通過(guò)該研究探索，我們不僅首次成功地證實(shí)了單一PCR適宜于焦磷酸測(cè)序方法，而且通過(guò)對(duì)比證實(shí)了PCR產(chǎn)物純化試劑盒比傳統(tǒng)切膠純化方法更加有效回收目的DNA片段，還支持了重復(fù)擴(kuò)增同一樣品對(duì)有效獲得目的基因片段的觀點(diǎn)，即對(duì)同一DNA樣品進(jìn)行3-5次重復(fù)擴(kuò)增，再混合所有的重復(fù)擴(kuò)增產(chǎn)物，增加目的基因的得率。
　　 2.焦磷酸測(cè)序法調(diào)查AMF多樣性及其系統(tǒng)學(xué)研究。在AMF自然資源的調(diào)查方

7、面，目前對(duì)于這方面的了解很有局限性，這也是阻礙對(duì)AMF有效利用的主要原因。研究背景是北美中部農(nóng)業(yè)產(chǎn)地，主要集中在加拿大草原三省，這里農(nóng)作物生產(chǎn)是其主要的的支柱產(chǎn)業(yè)，如能對(duì)菌根進(jìn)行有效利用無(wú)疑是對(duì)農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)有力保障。我們對(duì)76個(gè)小麥大田采樣點(diǎn)的AMF生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了調(diào)查，總采樣面積覆蓋了2800多萬(wàn)公頃加拿大草原地區(qū)，采用DNA條形碼標(biāo)記的高通量焦磷酸測(cè)序方法。結(jié)果共測(cè)得33個(gè)AMF分子分類單位(OTU)，系統(tǒng)學(xué)分析顯示14個(gè)OT

8、U歸于Funneliformis和Rhizophagus屬，16個(gè)OTU歸于Claroideoglomus屬，還有3個(gè)是多孢囊霉屬(Diversisporales)。多重反應(yīng)行排序(multiresponsepermutationprocedure，MRPP)分析顯示雖然有些AMF種類在各個(gè)土壤類型中均有分布，但其分布特點(diǎn)受土壤類型的影響(P=0.04)，其中黑鈣土(BlackChemozem)中含有最豐富和多樣的AMF種類。
　

9、　 3.AMF生態(tài)分布特點(diǎn)及土壤環(huán)境影響因素研究。大量研究表明AMF資源分布受環(huán)境因素的影響，如土壤pH值可以影響菌根侵染率和種類多樣性。本論文的第三部分研究結(jié)合實(shí)際測(cè)量的土壤營(yíng)養(yǎng)元素指標(biāo)和土壤物理性質(zhì)，找出影響菌根真菌分布的具體土壤環(huán)境因素。主要檢測(cè)內(nèi)容有：四種耕作土壤類型-黑鈣土(BlackChernozem)、褐鈣土(BrownChernozem)、深褐鈣土(Dark.BrownChernozem)、灰鈣土(GrayCherno

10、zem)的基本生化性質(zhì)檢測(cè)；利用植物根系與土壤離子交換生化信號(hào)傳感器(PlantRootSensor，PRS)檢測(cè)土壤主要營(yíng)養(yǎng)元素N、P、K，微量元素測(cè)定(Ca、Mg、Fe、Mn、Cu、Zn、B、S、Al)以及有害物質(zhì)Pb、Cd的檢測(cè)；土壤pH值、土壤顆粒密度、速效磷、總氮含量的測(cè)定；土壤菌絲量以及小麥根侵染率測(cè)定；小麥地上部分生物量和組織N、P含量的測(cè)定；對(duì)AMF目的基因(18SrDNA)擴(kuò)增及焦磷酸測(cè)序。數(shù)理統(tǒng)計(jì)通過(guò)冗余分析發(fā)現(xiàn)：A