大西洋鱈魚T細胞分化相關(guān)基因及牙鲆組織中Ig+細胞分布與應答的研究.pdf

1、據(jù)報道，CD4+和CD8+T細胞在硬骨魚類中是存在的，并且在免疫系統(tǒng)中起著重要的作用。本文克隆鑒定了大西洋鱈魚T細胞分化的五個相關(guān)基因，包括NF-κB抑制因子、TBK1、GATA-3、Foxp3、EOMES、并對其在體內(nèi)的分布表達、啟動區(qū)域結(jié)構(gòu)和功能進行了研究，為進一步研究大西洋鱈魚T細胞分化信號通路打下基礎(chǔ)，本文還對牙鲆抗體陽性細胞在組織中的分布及免疫應答進行了研究。
　　 TBK1也被稱為NF-κB活性激酶(NAK)，是Iκ

2、-B激酶(IKK)家族中的一員，參與先天性和特異性免疫應答。大西洋鱈魚的TBK1基因是由2190bp個核苷酸編碼729個氨基酸的多肽組成。通過實時熒光定量PCR-檢測，TBK1在鱈魚的腎臟中含量最高。體內(nèi)通過PMA、polyI：C和β-glucan刺激都能促進TBK1的表達。通過檢測TBK1轉(zhuǎn)錄起始位點上游的875bp核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)一些已知轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合序列和位點。通過構(gòu)建報告基因載體，轉(zhuǎn)染到CHSE-214細胞中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)啟動子和一

3、些順式作用因子分布在離轉(zhuǎn)錄起始位點-87Sbp到-425bp和-245到+28bp區(qū)域。
　　 NF-κB是一個重要的細胞免疫應答基礎(chǔ)調(diào)節(jié)因子，控制著很多的轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因家族，如c-Jun，STATs，GATAs，T-Box.等等，NF-κB往往是第一個應對細胞刺激產(chǎn)生免疫應答的細胞因子。NRF基因是NF-κB的一個抑制因子，由3397bp個核苷酸序列組成，包含2394bp核苷酸長度的開放閱讀框編碼797個氨基酸序列，NRF蛋白含

4、有一個G-patch結(jié)構(gòu)域和R3H功能結(jié)構(gòu)域，這兩個結(jié)構(gòu)域序列非常的保守。通過對NRF亞細胞定位分析，載體轉(zhuǎn)染到細胞48h后，NRF蛋白向細胞核靠近或進入細胞核中，我們推測NRF在細胞核中執(zhí)行其功能。
　　 Eomes是T-bet在CD8T細胞中旁系同源基因，是T-box家族中的一員。報道稱Eomes是CD8T細胞分化重要的調(diào)節(jié)因子。本研究中，我們克隆鑒定了Eomes的全基因序列(2618 bp)，并對其啟動子區(qū)域進行了分析。在

5、Eomes的上游區(qū)域，含有NF-E2，S8，GATA-1/2，HSF2，和Ets-1.轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，啟動區(qū)域報告基因載體分析，Eomes的啟動區(qū)域主要分布在-694到-376。qRT-PCR分析，Eomes在組織中的分布廣泛，在脾臟和前腎中的表達量最高。
　　 GATA-3是CD4+原代細胞向Th2細胞分化的關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子。大西洋鱈魚的GATA-3基因由1320bp核苷酸開放閱讀框，編碼440個氨基酸組成。擁有兩個高度保守

6、的鋅指結(jié)構(gòu)，我們還克隆得到了一個沒有鋅指結(jié)構(gòu)的GATA-3的剪切體，這個剪切體由828bp核苷酸組成的開放閱讀框，編碼276個氨基酸組成。將GATA-3和它的剪切體構(gòu)建帶有紅色熒光蛋白的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到CHSE-214細胞中，48小時后發(fā)現(xiàn)兩種蛋白都在靠近或進入到細胞核中。將兩個基因構(gòu)建表達質(zhì)粒，將其跟GATA-3報告基因載體同時轉(zhuǎn)染到細胞中，發(fā)現(xiàn)GATA-3能夠促進報告基因表達而GATA-3剪切體則不能，GATA-3剪切體也沒有干擾到全

7、長GATA-3基因的功能。實時定量PCR檢測結(jié)果顯示，兩種GATA-3基因都在鰓上有較高的表達，意外地是PMA刺激的原代前腎細胞，GATA-3剪切體有超過10萬倍的表達。PolyI：C和β-glucan抑制了GATA-3剪切體的表達。
　　 Foxp3是T細胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子，當機體受到外界刺激后免疫調(diào)節(jié)的過程中，對Treg細胞分化起著關(guān)鍵作用，我們克隆鑒定了大西洋鱈魚Foxp3基因的全長cDNA核苷酸序列，在其編碼的蛋白質(zhì)中含

8、有一個Forkhead結(jié)構(gòu)域，一個C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域和一個leucine-zipper結(jié)構(gòu)域，大西洋鱈魚Foxp3基因在鰓中的表達量最高。此外我們克隆了Foxp3上游1615bp的核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)了一些已知的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，通過構(gòu)建報告基因載體，轉(zhuǎn)染到CHSE-214細胞中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)啟動子及一些順式作用因子分布-400bp到TSS。
　　 對牙鲆免疫球蛋白的研究中，應用單克隆抗體、組織學、免疫細胞化學、免疫組織化學和流式細胞

9、術(shù)對牙鲆外周血、腎臟、肝胰臟、腸道、脾臟組織中Ig+細胞進行了定位和數(shù)量評估。結(jié)果表明，在以上免疫相關(guān)組織中均發(fā)現(xiàn)Ig+細胞。應用丙酮固定的外周血細胞，免疫細胞化學指示的主要是細胞質(zhì)中Ig陽性的細胞；脾臟中Ig+細胞一般成簇分布于黑色素巨噬細胞中心和血管周圍；在前腎和后腎中也都觀察到了Ig+細胞，單個或成簇存在于血管周圍；肝胰臟中的Ig+細胞主要存在于肝組織中，單個存在且沒有規(guī)律性，胰組織中沒有發(fā)現(xiàn)Ig+細胞；腸道作為重要的粘液免疫器官