重金屬鉛脅迫下玉米苗期根系miRNA的鑒定及相關(guān)miRNA的表達(dá)分析.pdf

1、工礦業(yè)的迅速發(fā)展,以及化肥、農(nóng)藥的大量施用,導(dǎo)致土壤耕作層中鉛等重金屬含量不斷增加。這不僅會(huì)影響和限制農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育,還會(huì)通過(guò)食物鏈危及人類和動(dòng)物的健康。玉米在全世界范圍內(nèi)廣泛種植,是重要的糧食作物,除籽實(shí)外,一些地區(qū)還將其莖葉作為牲畜的青貯飼料。同時(shí),玉米生物學(xué)產(chǎn)量高,有潛力成為新的土壤修復(fù)植物。miRNA是一類具有20-24 nt序列長(zhǎng)度的非蛋白質(zhì)編碼的內(nèi)源小分子RNA,它們?cè)谥参锷L(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。因此

2、,尋找與重金屬脅迫響應(yīng)相關(guān)的重要miRNA,初步揭示由miRNA介導(dǎo)的玉米鉛轉(zhuǎn)運(yùn)及抗性機(jī)制顯得十分迫切。
　　 本研究在課題組前期研究的基礎(chǔ)上,以篩選獲得的高積累鉛玉米自交系178和低積累鉛玉米自交系9782為材料,通過(guò)基于Solexa原理的深度測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)方法獲得重金屬Pb脅迫下玉米根系中表達(dá)的miRNA及其靶基因。結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)對(duì)與重金屬脅迫相關(guān)的重要候選miRNA進(jìn)行表達(dá)分析,

3、并采用半定量RT-PCR對(duì)其靶基因進(jìn)行驗(yàn)證,主要結(jié)果如下:
　　 1.在根系中共檢測(cè)到92個(gè)已知的miRNA和378個(gè)新的miRNA。92個(gè)已知的miRNA分別屬于18個(gè)miRN+A家族,它們?cè)跀M南芥、水稻和玉米等植物上均存在進(jìn)化上的保守性。378個(gè)新的miRNA分別屬于185個(gè)miRNA家族,其中20個(gè)miRNA家族在禾本科植物中存在不同程度的保守性。
　　 2.本研究中新發(fā)現(xiàn)的6個(gè)miRNA(zma-root-miR

4、5,zma-root-miR37,zma-root-rniR68,zma-root-miR155,zma-root-miR164和zma-root-miR184)與目前已知的miRNA169,miRNA164和miRNA171家族在序列上具有相似性,且少于4個(gè)堿基的差異。因此推測(cè)這6個(gè)新的miRNA可能屬于這些已知miRNA家族的新成員。
　　 3.靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果表明,92個(gè)已知miRNA的靶基因共靶向54個(gè)蛋白,進(jìn)一步的功能預(yù)

5、測(cè)發(fā)現(xiàn),這些基因涉及了轉(zhuǎn)錄調(diào)控、物質(zhì)能量代謝、電子傳遞、脅迫響應(yīng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程。
　　 4.對(duì)于新發(fā)現(xiàn)的miRNA,共預(yù)測(cè)得到489個(gè)可能的靶基因,其中453個(gè)靶基因能夠預(yù)測(cè)其功能,36個(gè)靶基因?qū)儆谖粗δ艿鞍?。這些靶基因大致可分為三類,第一類主要包括一些代謝相關(guān)基因,第二類為轉(zhuǎn)錄因子,第三大類群是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
　　 5.在本研究中,新發(fā)現(xiàn)的miRNA還靶向一些陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)子,如ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子、低親和力陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)子和重金屬轉(zhuǎn)

6、移P型ATP酶等。這些基因在植物細(xì)胞遭受重金屬脅迫后的解毒過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用,因此這些miRNA及其靶基因很可能參與Pb脅迫響應(yīng)。
　　 6.研究還發(fā)現(xiàn)了一些與逆境脅迫響應(yīng)有關(guān)的蛋白,如錳超氧化物岐化酶、過(guò)氧化物酶前體、磷脂過(guò)氧化氫谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等,這些蛋白能夠清除由Pb脅迫產(chǎn)生的過(guò)多的活性氧(ROS)。
　　 7.結(jié)合靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果,選擇了6個(gè)與重金屬脅迫相關(guān)的miRNA進(jìn)行熒光定量PCR分析。結(jié)果表明,178

7、中,48h時(shí)的不同Pb脅迫濃度對(duì)6個(gè)miRNA表達(dá)的影響不明顯,但在72h時(shí),不同Pb脅迫濃度對(duì)178的影響較為明顯,且大多有誘導(dǎo)表達(dá)的趨勢(shì)。而在9782中,不同Pb脅迫濃度對(duì)48h時(shí)miRNA的表達(dá)影響較大,且低濃度脅迫對(duì)其影響更為明顯。
　　 8.對(duì)植物絡(luò)合素合成酶、重金屬P型轉(zhuǎn)移ATP酶、ABC類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和NAC1轉(zhuǎn)錄因子等6個(gè)候選miRNA的靶基因在178中的表達(dá)進(jìn)行半定量RT-PCR分析。結(jié)果表明,6個(gè)靶基因在脅迫48