重要植物疫害的檢測(cè)鑒定及分子系統(tǒng)學(xué)研究.pdf

1、有害生物入侵已成為對(duì)生物多樣性構(gòu)成嚴(yán)重威脅的第二大因素,僅次于生態(tài)環(huán)境的破壞,引起世界各國普遍關(guān)注。我國是農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易的第四大進(jìn)口國和第五大出口國,是全球受外來生物入侵影響最大的國家之一,隨著我國對(duì)外貿(mào)易的進(jìn)一步擴(kuò)大,植物及其產(chǎn)品的調(diào)運(yùn)日趨頻繁,伴隨著旅游業(yè)的大發(fā)展,外來有害生物入侵的形勢(shì)愈加嚴(yán)峻,已經(jīng)成為危害我國生物多樣性、生態(tài)環(huán)境和國民經(jīng)濟(jì)的一個(gè)十分重要和緊迫的問題。加強(qiáng)口岸檢疫,構(gòu)筑防范外來疫害入侵的第一道屏障,對(duì)保障我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安

2、全,服務(wù)于農(nóng)產(chǎn)品的出口和國內(nèi)貿(mào)易具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 近年來,順應(yīng)城市園林綠化和農(nóng)牧業(yè)的需求,國外大量草種進(jìn)入我國,尤其早熟禾、黑麥草、雀麥、紫羊茅和翦股穎等禾本科草種進(jìn)口量大,它們是腥黑粉菌的重要寄主,腥黑粉菌嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì),其中小麥矮腥黑穗病(Tilletia controversa Kühn,TCK)是我國規(guī)定禁止進(jìn)境的植物檢疫性有害生物,既為害小麥,又感染多種禾本科草種。這些草種還傳帶其它在我國尚未發(fā)生的腥黑

3、粉菌,作為土傳種帶真菌病害,一旦傳入,防治、根除非常困難。本研究建立了黑麥草上3種具網(wǎng)紋狀、冬孢子形態(tài)相似的腥黑粉菌TCK、T.lolii及T.vankyi的三重PCR檢測(cè)方法,用于檢測(cè)菌絲和冬孢子基因組DNA,實(shí)現(xiàn)對(duì)三種腥黑粉菌的同時(shí)檢測(cè),降低了檢測(cè)成本,便于口岸推廣應(yīng)用；建立了雀麥上T.bromi的分子檢測(cè)方法,用于檢測(cè)菌絲和冬孢子基因組DNA；建立了翦股穎上T.sphaerococca和TCT菌絲的雙重PCR和冬孢子的套式雙重PC

4、R檢測(cè)方法；建立了紫羊茅上T.vankyi分子檢測(cè)方法,用于檢測(cè)菌絲和冬孢子基因組DNA；建立了早熟禾上T.sp.和T.fusca菌絲的雙重PCR和冬孢子的套式雙重PCR檢測(cè)方法,并基于IGS1基因的Tilletia屬的系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示T.sp.與T.bromi的親緣關(guān)系較近,與T.fusca親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)；針對(duì)禾本科草籽上2種腥黑粉菌新種T.vankyi和T.puccinelliae進(jìn)行了形態(tài)學(xué)及萌發(fā)生理特性的研究。研究結(jié)果被納入2

5、篇新種發(fā)布的文獻(xiàn)；并進(jìn)行了2個(gè)新種基于IGS1基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析,結(jié)果與2篇新種發(fā)布文獻(xiàn)的結(jié)論一致；建立了黑麥草、雀麥、翦股穎、紫羊茅和早熟禾5類禾本科草種上腥黑粉菌的檢疫鑒定程序。
　　 大豆是我國重要的糧食作物,近年來進(jìn)口量激增。菜豆莢斑駁病毒(Bean podmottle virus,bpMV)是我國規(guī)定禁止進(jìn)境的植物檢疫性病毒,能導(dǎo)致大豆品質(zhì)降低和產(chǎn)量下降,可隨種子進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播,是大豆上一種非常重要的種傳病害,我國

6、未分布。本研究針對(duì)進(jìn)口大豆BPMV的檢測(cè),建立了一步法RT-PCR和一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法。依據(jù)BPMV的外殼蛋白編碼基因設(shè)計(jì)了特異引物和特異Taqman探針,特異引物的擴(kuò)增片段約為500bp,陽性質(zhì)粒的實(shí)時(shí)熒光PCR方法的檢測(cè)下限為20fg/μL,是一步法RT-PCR方法的100倍,檢測(cè)時(shí)間由至少8h縮短至4h,一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法具有快捷、靈敏、準(zhǔn)確和簡(jiǎn)便的特點(diǎn),適于口岸檢測(cè)；種臍色斑與病毒攜帶相關(guān)性分析表明,

7、種臍褐色斑駁的大豆種子BPMV檢測(cè)呈陽性,大豆花葉病毒(Soybean mosaic virus,SMV)檢測(cè)呈陰性,種臍黑色斑駁的大豆種子SMV檢測(cè)呈陽性,BPMV檢測(cè)呈陰性,種臍褐色斑駁的大豆種子DAS-ELISA檢測(cè)表明不攜帶其它8種大豆種傳病毒；基于BPMV的外殼蛋白編碼基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析表明從進(jìn)境美國大豆截獲的BPMV分離物可能歸屬于亞組Ⅱ。
　　 美國白蛾(Hypantria cutlea Drury)是世界性檢疫害

8、蟲,適應(yīng)性強(qiáng),食性雜,給森林樹種、園林綠化樹種及果樹造成嚴(yán)重危害。線粒體基因組具有基因組小、基因組成穩(wěn)定、普遍為母性遺傳和較少發(fā)生重組等特點(diǎn),成為基因組學(xué)和進(jìn)化研究的理想材料。相對(duì)于鱗翅目龐大的類群,已測(cè)定的鱗翅目線粒體基因組的種類非常有限,因此,對(duì)鱗翅目線粒體基因組進(jìn)行測(cè)序和分析,對(duì)揭示鱗翅目線粒體基因組的進(jìn)化以及研究鱗翅目超家族間復(fù)雜的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系具有重要意義。本研究對(duì)美國白蛾進(jìn)行了線粒體基因組全序列的測(cè)定,其線粒體全基因組序列為1

9、5481bp,環(huán)狀雙鏈,具有鱗翅目線粒體基因組典型的基因構(gòu)成和順序；其IRNAMet基因易位到tRNAIle基因的5’端上游位置,與果蠅中推定的昆蟲祖先基因排列存在差異；mtDNA組成偏好于堿基A和T,AT含量高達(dá)80.38％,其AT組成偏好性呈現(xiàn)出弱陽性(0.010),表明AT堿基中偏好使用A；13個(gè)蛋白編碼基因中,除COI之外的所有蛋白編碼基因均以典型的ATN作為起始密碼子,美國白蛾的COI基因起始密碼子暫定為CGA,13個(gè)蛋白編碼

10、基因中有4個(gè)采用了不完整的T或者TA作為終止密碼子；tRNASer(AGN)的二氫尿嘧啶臂(DHU)不能形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu),其他所有的tRNAs都具有線粒體tRNA典型的三葉草二級(jí)結(jié)構(gòu)；在tRNASer(AGN)和ND1之間的基因間隔區(qū)序列具有鱗翅目保守的ATACTAA模序；美國白蛾357bp的A+T富集區(qū)由非重復(fù)性序列構(gòu)成,其特征序列包括ATAGA模序后緊隨18bp的poly-T stretch,ATTTA模序后緊隨的微衛(wèi)星樣的(AT

11、)8單元,最后是一個(gè)11bp的poly-A位于tRNAMet基因上游；根據(jù)已有鱗翅目昆蟲線粒體基因組序列進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)育分析表明,三種夜蛾總科昆蟲中,美國白蛾與舞毒蛾親緣關(guān)系較近,與大袋蛾親緣關(guān)系較遠(yuǎn),結(jié)果還支持夜蛾總科(美國白蛾、舞毒蛾和大袋蛾)與尺蛾總科(桑尺蠖)是單系發(fā)生的假說,然而鳳蝶總科(褐脈粉蝶、苧麻珍蝶和紋蝶)處于鱗翅目單系的基部,這一結(jié)果與傳統(tǒng)分類結(jié)論不同。
　　 高梁屬中有重要的糧食作物和優(yōu)良牧草,也有我國規(guī)定禁

12、止進(jìn)境的三種檢疫性雜草假高粱、黑高粱和絲克高粱。根據(jù)GenBank中高粱Sorghum bicolor的adh1全基因設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增并測(cè)定了8個(gè)植物材料約2000bp的adh1基因部分序列,結(jié)合GcnBank中24個(gè)Sorghum屬種的同源序列,分別構(gòu)建了MP、ML和NJ三種分子進(jìn)化樹,得到了基本相同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),結(jié)果表明:(1)高梁屬可明顯分為三大支,一支是Eusorghum亞屬,一支是Chaetosorghum和Heterosorgh

13、um兩個(gè)亞屬,這兩個(gè)分支包含2n=20、40,染色體較小的種類,另一分支包括Parasorghum和Stiposorghum兩個(gè)亞屬,包含2n=10的種類和它們的多倍體近緣種,染色體相對(duì)較大；(2)Eusorghum亞屬中,三種檢疫性雜草S.halepense、S.almum、S.silk與其它形態(tài)近似種S.bicolor及其亞種S.arundinaceum、S.sudanense、S.propinquum聚為一類,與形態(tài)學(xué)的研究結(jié)論一

14、致,S.silk、S.sudanense和S.almum表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系；(3)S.almum的Adh1基因表現(xiàn)出明顯的地理分化；(4)Parasorghum亞屬的S.purpureosericeum和S.versicolor、S.nitidum和S.leiocladum聚在一起,而該亞屬中的S.matarankense、S.grande、S.timorense卻與亞屬Stiposorghum的種聚在一起,表現(xiàn)出更近的親緣關(guān)系；(5

15、)S.macrospermum和S.laxiflorum之間具有最近的親緣關(guān)系。
　　 本研究建立了口岸經(jīng)常截獲、已對(duì)我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成現(xiàn)實(shí)威脅的5類禾本科草種上腥黑粉菌、大豆種傳菜豆莢斑駁病毒的分子檢測(cè)技術(shù),用于口岸近緣種及株系的甄別、國內(nèi)田間病害早期診斷和疫情動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè),并對(duì)網(wǎng)狀腥黑粉菌、菜豆莢斑駁病毒、美國白蛾、高粱屬中3種檢疫性雜草進(jìn)行了分子系統(tǒng)學(xué)研究。研究結(jié)果有助于從分子水平闡明種間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及病毒的株系分化,不僅具有