豬糞好氧堆肥工藝及堆肥微生物的篩選、純化與發(fā)酵的研究.pdf

1、堆肥是處理畜禽場廢棄物的主要手段之一,這種處理方法具有投資小,效益商,可以使大量有機(jī)固體廢棄物重復(fù)資源化利用等優(yōu)點(diǎn),但是同時(shí)也存在發(fā)酵周期長、堆肥產(chǎn)品質(zhì)量不高等缺陷。為了提高堆肥產(chǎn)品的質(zhì)量、縮短堆肥周期、提高堆肥效率,本試驗(yàn)主要從堆肥調(diào)理劑的選擇、堆肥微生物菌種的篩選、篩選菌株的功能及對堆肥中微生物群落的影響等方面開展了研究,試驗(yàn)結(jié)果總結(jié)如下:
　　 1.不同調(diào)理劑對豬糞好氧堆肥過程的影響
　　 分別以鋸末、米糠和木屑為

2、調(diào)理劑,調(diào)節(jié)堆肥原料的碳氮比為25:1,含水率為60％,通風(fēng)方式采用人工翻堆的方式進(jìn)行豬糞好氧堆肥。從各調(diào)理劑堆肥的溫度、含水率、pH值、有機(jī)碳含量、發(fā)芽指數(shù)、全氮含量及碳氮比等方面進(jìn)行了比較。3個(gè)堆體都經(jīng)歷了快速升溫期、持續(xù)高溫期和緩慢降溫期3個(gè)時(shí)期,均可以實(shí)現(xiàn)好氧堆肥的腐熟,并使堆肥產(chǎn)品達(dá)到國家糞便無害化衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。不同的調(diào)理劑對豬糞好氧堆肥堆體的溫度變化影響較大,其中,以鋸末為調(diào)理劑的堆體升溫最快,米糠次之,木屑升溫最慢。以米糠為調(diào)

3、理劑的堆體的高溫期最長,鋸末次之,木屑的高溫期最短。3個(gè)堆體含水率的變化趨勢相同,都隨著堆肥的進(jìn)程而不斷降低,都從開始的60％左右降低到33％左右。使用3種不同調(diào)理劑進(jìn)行豬糞好氧堆肥的最終產(chǎn)品中氮元素的相對含量差異顯著(P<0.05),以鋸末和米糠為調(diào)理劑的堆肥產(chǎn)品的全氮含量較高,為2.12％和2.10％,以木屑為調(diào)理劑的堆肥產(chǎn)品的的全氮含量較低,為1.90％。
　　 2.堆肥中產(chǎn)葡聚糖內(nèi)切酶微生物的篩選、分離與純化
　　

4、 通過以CMC-Na為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基進(jìn)行初篩得到17株不同的微生物,經(jīng)濾紙培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)篩后得到一株能夠產(chǎn)CMC酶的菌株。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn),該菌株為產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性菌,并通過細(xì)菌16S rDNA的通用引物對該菌株的16S rDNA擴(kuò)增測序,與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列比對后發(fā)現(xiàn),該菌株的16S rDNA序列與枯草芽孢桿菌的16S rDNA序列相似度達(dá)到100％,因此該菌株被鑒定為枯草芽孢桿菌,命名為Subtilisbacillus

5、dcy-1,并保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),保藏編號(hào)為:CCTCC M208122。分離菌株的最佳液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基為:麩皮1.5％,豆粕1.5％,NaCl0.5％,CaCl20.05％,MgSO40.05％,酵母提取物0.1％；產(chǎn)酶條件為:發(fā)酵溫度為30℃,培養(yǎng)基初始pH值為7.0,培養(yǎng)時(shí)間為40h時(shí)CMC酶活達(dá)到最大。菌株所產(chǎn)的CMC酶的最佳作用溫度為55℃,最佳pH值為7.5,Na+、Ca2+、Ni2+對CMC酶酶促反應(yīng)

6、有一定的促進(jìn)作用,Cu2+和Mn2+對CMC酶酶促反應(yīng)有顯著的抑制作用。CMC酶在低于60℃時(shí)熱穩(wěn)定性較好,在pH值為5-8時(shí)比較穩(wěn)定。
　　 3.分離并鑒定了枯草芽孢桿菌Subtilis Bacillus-dcy1的Egl基因
　　 通過設(shè)計(jì)引物獲得了完整的CDS序列,GenBank數(shù)據(jù)庫登陸號(hào)為,HM036060,通過生物信息學(xué)分析軟件對基因的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進(jìn)行了預(yù)測。以枯草芽孢桿菌為出發(fā)菌株,構(gòu)建了枯草芽孢桿菌Egl基

7、因重組原核表達(dá)載體pGEX-KG,優(yōu)化后的最佳條件為IPTG誘導(dǎo)3.5h,其濃度為0.6mmol/L,主要以可溶的形式存在,通過對表達(dá)產(chǎn)物活性的測定發(fā)現(xiàn),葡聚糖內(nèi)切酶活性可達(dá)121.23U/ml。
　　 4.堆肥中微生物總DNA提取方法的改進(jìn)研究
　　 針對堆肥中微生物抗性比較強(qiáng)的特點(diǎn),設(shè)計(jì)了通過蛋白酶和蝸牛酶2次消化的堆肥樣品的DNA提取方法。分別從對微生物細(xì)胞的裂解效率、DNA產(chǎn)量、DNA回收效率及PCR可擴(kuò)增性等方

8、面對3種不同的DNA提取方法進(jìn)行了研究比較,結(jié)果表明,3種方法都能夠從堆肥樣品中成功的提取出微生物的DNA,但是,雙酶裂解法比其他2種方法效率更高,更加經(jīng)濟(jì)實(shí)用。本試驗(yàn)中所提出和改進(jìn)DNA提取方法可以有效的應(yīng)用于堆肥樣品中,由于堆肥樣品中的雜質(zhì)和干擾物要比土壤、污水等環(huán)境樣品中更加復(fù)雜一些,所以,這種方法也可以應(yīng)用于其他環(huán)境樣品微生物的提取與純化。
　　 5.添加外源微生物對堆肥細(xì)菌群落的影響
　　 堆體接種外源微生物后

9、能夠明顯的提高堆體的溫度升高速度和堆體的最高溫度,延長了高溫期的時(shí)間。通過RFLP技術(shù)快速、準(zhǔn)確地研究了豬糞好氧堆肥過程中不同時(shí)期的細(xì)菌群落的變化。比較了接種外源微生物的堆體和自然堆肥堆體中細(xì)菌種類和數(shù)量的差異,結(jié)果表明接種外源微生物可以改變堆肥中微生物群落的變化,所接種的微生物能夠適應(yīng)堆肥的環(huán)境,并成為優(yōu)勢菌群。通過與NCBI數(shù)據(jù)庫中比較,試驗(yàn)中共發(fā)現(xiàn)35條序列與已知微生物序列相似性很低,這些序列有可能是堆肥中尚未發(fā)現(xiàn)的新物種,它們在