2006年-2010年山東省雞傳染性支氣管炎病毒分離株基因型和血清型分析.pdf

1、本研究自2006年—2010年期間從山東省各地分離和收集了19個禽傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)分離株，對其生物學(xué)特性和基因型進行研究。根據(jù)參考文獻報道，設(shè)計合成了三對特異性引物分別對分離株的三種主要的結(jié)構(gòu)基因S1、N和M基因進行了擴增，克隆和序列分析，以探究山東省IBV 毒株之間以及與參考毒株之間基因的遺傳變異情況及系統(tǒng)進化關(guān)系，對流行株基因型進行劃分，研究其分子生物學(xué)特征；并通過

2、SPF雞胚制備了H120、MA5和491疫苗株和部分分離株的陽性血清，通過雞胚血清中和試驗對分離株的血清型和抗原性變異進行分析，探討山東省 IB 流行的背景和情況，并探討S1基因分型與血清中和試驗分型之間的關(guān)系。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　 ⑴對疑似雞傳染性支氣管炎的病料采用常規(guī)方法處理后接種9～11日齡的SPF雞胚，接種雞胚后，96h內(nèi)收取雞胚的尿囊液，并將剩余雞胚孵化至18日齡觀察雞胚生長狀況和雞胚病變。第一代接種沒有或少

3、數(shù)雞胚表現(xiàn)出胚體的生長抑制。盲傳2～5代后，發(fā)現(xiàn)雞胚表現(xiàn)出明顯的生長抑制、侏儒胚、胚體矮小、發(fā)育受阻、胚體彌漫性出血。病毒的雞胚尿囊液對雞外周紅細胞沒有血凝活性。同時與ND弱毒疫苗株LaSota同胚接種時，可干擾ND 病毒的增殖。電鏡下觀察，多數(shù)病毒粒子呈球形，有囊膜，表面有疏松排列的棒狀纖突，呈現(xiàn)冠狀病毒粒子的典型特征，未發(fā)現(xiàn)其他病毒粒子的存在。初步診斷該病毒是雞傳染性支氣管炎病毒。
　　 ⑵19個IBV分離株均擴增出目的基因

4、片段，序列比對發(fā)現(xiàn)：與疫苗株H120相比，19個分離株S1基因變異程度較大，存在廣泛的基因突變和氨基酸替代，多數(shù)毒株還存在氨基酸的插入；N基因無堿基的缺失和插入，僅存在核苷酸的突變和氨基酸的替代；M基因除毒株CK/CH/SD09/005插入三個堿基外，其它18個分離株僅存在少數(shù)的堿基突變和氨基酸替代。
　　 ⑶對S1、N和M基因的遺傳進化分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：多數(shù)分離株之間核苷酸和氨基酸序列同源性較高，與國內(nèi)分離株LX4關(guān)系較近，是山東

5、省主要的流行株類型，且S1基因、N基因和M基因的進化關(guān)系相對平行；而分離株SDWF0608、CK/CH/SD09/005和SDTA06111的S1、N和M基因處于不同的進化分支，推測這三個分離株可能發(fā)生了基因重組。
　　 ⑷雞胚中和試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：IBV疫苗株和部分分離株之間僅能發(fā)生單向中和試驗或能夠雙向交叉中和的毒株之間抗原相關(guān)系數(shù)小于25％（屬于不同血清型）。8個IBV分離株中，僅有SDWF0608、SDLY0612、SDLY

6、0701 3個分離株與疫苗株H120同屬Mass血清型的不同亞型，其它5個分離株與H120和491屬于不同的血清型，抗原相關(guān)性均低于25％。本研究結(jié)果從體液免疫的角度解釋了臨床上雞群免疫H120或491疫苗后仍然經(jīng)常發(fā)生IBV感染的原因，也提示山東省目前IBV流行株可能存在多個血清型。
　　 ⑸結(jié)合S1基因序列同源性和抗原相關(guān)性結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)分離株SDTA06111與H120 同屬基因I群，且S1基因核苷酸序列的同源性分別達到99

7、.3％，但是二者抗原相關(guān)系數(shù)僅18％，不屬于同一個血清型；分離株SDLY0612與H120的抗原相關(guān)系數(shù)最高（70.71％），但是兩者S1基因序列的同源性僅78.2％。由此推測S1基因同源性和血清型沒有明顯的相關(guān)性，IBV可能通過少數(shù)基因突變導(dǎo)致中和性抗原表位的改變，從而產(chǎn)生新的血清型。
　　 ⑹廣泛的基因突變、插入、缺失和IBV毒株間的基因重組是造成山東省IBV毒株變異的主要原因。目前IBV流行株存在多個血清型，必須在全面鑒定