橡膠樹炭疽病菌T-DNA插入突變體庫的構(gòu)建及其分子研究.pdf

1、由膠孢炭疽和尖孢炭疽菌聯(lián)(復(fù))合侵染引起的橡膠樹炭疽病是目前國內(nèi)天然橡膠生產(chǎn)上最為嚴(yán)重的葉部病害之一,危害逐年加重。炭疽病菌也是研究植物--病原互作的重要模式真菌。為開展炭疽病菌致病分子機(jī)制研究,我們?cè)趶V泛收集國內(nèi)橡膠樹主栽區(qū)炭疽病菌,明確其基礎(chǔ)生物學(xué)特性和分類地位,以及完成國內(nèi)主要種質(zhì)對(duì)膠孢和尖孢炭疽菌的抗病性評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上,通過優(yōu)化建立的農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化體系成功轉(zhuǎn)化膠孢炭疽菌菌株HCGHN4和尖孢炭疽菌菌株HCGYN12,并對(duì)轉(zhuǎn)化子

2、進(jìn)行了表型篩選和分子分析。這為進(jìn)一步確定和分離炭疽菌致病基因及其功能分析提供了研究材料。
　　 對(duì)來自不同地方的22個(gè)橡膠炭疽病菌rDNA-ITS區(qū)的5.8 S及兩側(cè)ITS序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),引起我國橡膠樹炭疽病的病原菌有尖孢炭疽和膠孢炭疽兩種;尖孢炭疽菌種內(nèi)遺傳變異較小,而膠孢炭疽菌種內(nèi)遺傳變異較大。
　　 開展了介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系的最適AS的濃度、共培養(yǎng)的時(shí)間、農(nóng)桿菌的誘導(dǎo)時(shí)間、農(nóng)桿菌的濃度、炭疽菌孢子濃度和共培養(yǎng)的溫度等影

3、響因子分析,獲得了適宜于橡膠樹膠炭疽菌炭疽菌的農(nóng)桿菌誘導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化體系;并利用含具有氯嘧黃隆抗性標(biāo)記的ILV1基因和報(bào)告基因GFP的二元載體pSULF.gfp,對(duì)橡膠樹炭疽病菌進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,成功獲得膠孢炭疽菌T-DNA插入轉(zhuǎn)化子2172個(gè)和尖孢炭疽菌T-DNA插入轉(zhuǎn)化子2263個(gè),轉(zhuǎn)化效率均達(dá)106個(gè)分生孢子＞300個(gè)轉(zhuǎn)化子。
　　 轉(zhuǎn)化子的特異引物PCR擴(kuò)增結(jié)果表明,T-DNA標(biāo)記已成功插入兩種橡膠樹炭疽病菌。隨機(jī)選取20個(gè)轉(zhuǎn)化

4、子進(jìn)行Sotlthem雜交分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)膠孢炭疽菌9個(gè)為單拷貝,7個(gè)為雙拷貝,3個(gè)為三拷貝以上插入,另外1個(gè)轉(zhuǎn)化子的實(shí)驗(yàn)沒有結(jié)果;尖孢炭疽菌8個(gè)單拷貝,7個(gè)雙拷貝,3個(gè)為三拷貝以上插入。兩菌株轉(zhuǎn)化子中,單拷貝轉(zhuǎn)化子約占比例為47.4％和44.4％。
　　 T-DNA的插入對(duì)兩種轉(zhuǎn)化子形態(tài)和生長(zhǎng)速率有一定影響,但目前尚未篩選到產(chǎn)孢能力、侵染力和致病力發(fā)生明顯改變的突變體。進(jìn)一步通過TAIL-PCR擴(kuò)增獲得了HCGYN12-153、