耐黃龍病寄主植物RGA的分離鑒定及侵染相關(guān)序列的表達(dá)分析.pdf

1、柑桔黃龍?。℉uanglongbing，HLB）是影響全球柑桔產(chǎn)業(yè)的一種毀滅性病害，會(huì)造成柑桔葉片斑駁、黃化，導(dǎo)致柑桔減產(chǎn)直至植株死亡。該病原菌至今未能得到穩(wěn)定的純培養(yǎng)，因此對(duì)其防治方法也受到極大的限制，目前尚未有有效的殺菌制劑，一旦發(fā)現(xiàn)病株就只能通過(guò)鏟除并焚燒病樹(shù)的方法來(lái)阻止黃龍病的傳染。利用抗病品種具有的某些特性來(lái)提高植物抗病性是植物病害防治的重要措施。柑橘黃龍病菌的寄主包括蕓香科的多種植物和其他科屬的植物，然而不同的植物種類(lèi)對(duì)病害

2、的感病性有著明顯的差異，因此利用感病性弱甚至是有耐病特征的植物分離其中抗病相關(guān)的基因進(jìn)行抗病育種，對(duì)于黃龍病這一類(lèi)危害極大、防治困難的病害尤其具有重要意義。進(jìn)行抗病育種研究首先需要具有抗病種質(zhì)資源或抗病基因，現(xiàn)有的柑桔品種中具有抗病特征的資源十分有限，從親緣關(guān)系較近的植物屬或科中得到相應(yīng)的抗病相關(guān)基因是進(jìn)行抗病育種的可行辦法。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，已通過(guò)圖位克隆法、轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法等方法分離鑒定到一些植物抗性基因，本研究的目的即是從

3、抗（耐）柑桔黃龍蕓香科植物中克隆抗病基因同源序列，為柑桔黃龍病的抗病育種提供一些基礎(chǔ)材料。
　　本論文的研究?jī)?nèi)容包括：
　?。?）根據(jù)已知植物抗性基因表達(dá)產(chǎn)物的保守區(qū)域核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(nucleotide binding site，NBS)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，以田間對(duì)黃龍病具有耐病特征的蕓香科寄主植物九里香和柚的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增其抗病基因同源序列(Resistance gene analogs,RGAs)，并對(duì)獲得的

4、序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，揭示不同寄主植物抗病基因的多樣性及進(jìn)化關(guān)系；
　　（2）以耐黃龍病的柑桔屬植物柚的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增RGAs，進(jìn)行克隆測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)RGA在甜橙嫁接HLB后的連續(xù)八次采樣中的表達(dá)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析。
　　主要的研究結(jié)果有：根據(jù)已知植物抗性基因蛋白NBS保守結(jié)構(gòu)域引用設(shè)計(jì)的5條簡(jiǎn)并引物，隨機(jī)組合成六對(duì)引物以九里香和柚的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通

5、過(guò)RFLP分析和克隆測(cè)序，共獲得43個(gè)抗性基因同源序列（Resistance gene analogs，RGAs）。NCBI序列比對(duì)結(jié)果顯示43個(gè)片段與已有報(bào)道的抗性基因及已克隆的抗性基因同源序列具有不同程度的同源性，其中有12個(gè)RGAs能翻譯成完整連續(xù)的氨基酸序列。通過(guò)Clustalx、DNAMAN等軟件分析RGAs及其推導(dǎo)的氨基酸的同源性，結(jié)果顯示它們都包含NBS-LRR類(lèi)抗性基因所具有的保守區(qū)域：P-loop、Kinase-2a、

6、GLPLAL，其與已克隆的煙草N、亞麻L(zhǎng)6、擬南RPS2、RPS5、RPP8、RPM1等多種抗病基因在保守區(qū)域氨基酸水平上的同源性為37.39％-43.43%，可望進(jìn)一步用于HLB抗病基因的分子篩選及遺傳圖譜的構(gòu)建。以柚的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，RFLP分析后選取6個(gè)差異片段送去測(cè)序，經(jīng)測(cè)序后通過(guò)DNAMAN等軟件對(duì)序列進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，其中有5個(gè)片段屬于NBS類(lèi)RGAs，比對(duì)結(jié)果顯示其與7個(gè)已知植物R基因的保守結(jié)構(gòu)域相應(yīng)氨基酸序列

7、同源性為19.71%-42.86%。此外，實(shí)驗(yàn)中得到的5條RGAs中，kinase-2a最后一個(gè)氨基酸皆為色氨酸，屬于non-TIR-NBS-LRR類(lèi)。對(duì)甜橙進(jìn)行嫁接黃龍病菌的處理后利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)5個(gè)RGAs在HLB侵染過(guò)程中的表達(dá)進(jìn)行研究觀察，結(jié)果顯示嫁接黃龍病病芽后的八次采樣中5個(gè)RGA的表達(dá)都有不同程度的變化，初步斷定與黃龍病的侵染相關(guān)。其中，GJ20和GJ31在實(shí)驗(yàn)組第2次采樣中表達(dá)量大幅上升，而在嫁接病原前后其余月份

8、的表達(dá)變化幅度較小，相對(duì)比較穩(wěn)定；GJ28在實(shí)驗(yàn)組第4次采樣時(shí)表達(dá)上調(diào)，其余幾個(gè)月表達(dá)趨于穩(wěn)定；GJ10在嫁接病原后3個(gè)月時(shí)表達(dá)下降，其余月份與對(duì)照組幾乎達(dá)到平衡；GJ35在嫁接病原后總體表達(dá)較對(duì)照組大幅度下調(diào)。根據(jù)表達(dá)情況，進(jìn)一步推測(cè)GJ20和GJ31較有可能與HLB菌的相關(guān)抗性基因相關(guān)?，F(xiàn)有研究證明RGA在植物基因組中廣泛存在，本研究中得到的序列為果樹(shù)抗病育種提供了潛在的應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)，通過(guò)病原誘導(dǎo)后RGA的表達(dá)情況的研究為HLB相