深海熱液區(qū)管狀蠕蟲的分子特征及對(duì)蝦microRNA的初探.pdf

1、深海熱液區(qū)是地球上典型的極端環(huán)境，盡管環(huán)境條件極其嚴(yán)酷，但以化能自養(yǎng)微生物為基礎(chǔ)的自養(yǎng)自給的共生體系卻蘊(yùn)育了這里生機(jī)勃勃的生物世界。極端的環(huán)境使這里的生物形成了獨(dú)特的防御與適應(yīng)性機(jī)制，引發(fā)了科學(xué)家們對(duì)諸如生命起源、演化、生物耐受極端環(huán)境的機(jī)制等一系列重大生物學(xué)問題的思考；同時(shí)代謝過程中形成的各種生物活性物質(zhì)也使其成為潛在的生物資源寶庫。 本研究以深海熱液區(qū)Juan de Fuca Ridge的典型生物管狀蠕蟲Ridgeiapis

2、cesae為研究對(duì)象，運(yùn)用SMART技術(shù)構(gòu)建了其cDNA文庫，各項(xiàng)指標(biāo)均符合文庫質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：文庫的容量為5.71×106個(gè)克隆，平均插入片段大小～1.0 kbp。在此基礎(chǔ)上，我們隨機(jī)挑取879個(gè)文庫克隆進(jìn)行EST測(cè)序。序列分析表明這些序列代表199個(gè)基因，根據(jù)功能特點(diǎn)這些基因包括基礎(chǔ)代謝相關(guān)蛋白、細(xì)胞骨架及膜相關(guān)蛋白、環(huán)境適應(yīng)性與防御相關(guān)蛋白、細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)蛋白、DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及蛋白翻譯相關(guān)蛋白等，比較全面的反映了

3、管狀蠕蟲Ridgeia piscesae的分子特征。序列分析還表明，與適應(yīng)性和防御性相關(guān)的基因顯示了基因的多樣性。其中，幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白最具多樣性，不僅幾丁質(zhì)酶水解區(qū)和幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)相互獨(dú)立，而且?guī)锥≠|(zhì)結(jié)合區(qū)也顯示豐富的多樣性，由不同的幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)共組成了23種不同的幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白；EST測(cè)序分析中還發(fā)現(xiàn)兩個(gè)溶菌酶基因帶有雙功能區(qū)，可能具有雙重功能；此外，肌紅蛋白基因也顯示了序列的多樣性。管狀蠕蟲Ridgeia piscesae的這些基因特

4、點(diǎn)將有助于我們了解生物對(duì)極端環(huán)境的適應(yīng)性機(jī)制，同時(shí)也有利于我們開發(fā)其中潛在的基因資源。 microRNA是真核生物中一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，廣泛參與生長(zhǎng)發(fā)育、器官形成、細(xì)胞增殖與凋亡、病毒防御等各個(gè)過程。對(duì)蝦作為一種重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，對(duì)其相關(guān)microRNA的分子特征還知之甚少。 本研究對(duì)日本囊對(duì)蝦Marsupenaeus japonicus microRNA途徑中相關(guān)的分子特征進(jìn)行了初步探索。Ar

5、gonaute是microRNA途徑中的重要蛋白之一，microRNA通過以Argonaute為核心的RISC復(fù)合體(RNA-induced silencing complex)對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行調(diào)控。因此，我們首先從日本囊對(duì)蝦中克隆得到這一關(guān)鍵蛋白Argonaute--Mjago，并對(duì)其分子特征進(jìn)行相關(guān)研究。序列分析表明Mjago含有Argonaute蛋白家族特有的PAZ和PIWI保守結(jié)構(gòu)域，并且其與節(jié)肢動(dòng)物的Argonaute1，尤其與

6、斑節(jié)對(duì)蝦 Penaeus monodon的Argonaute1具有極高的同源性。對(duì)不同組織Mjago轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該基因在對(duì)蝦各個(gè)組織中均有轉(zhuǎn)錄，尤其以血細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平最高。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，Mjago的轉(zhuǎn)錄水平與WSSV病毒感染密切相關(guān)，在病毒感染后其轉(zhuǎn)錄水平上升，在感染48小時(shí)后轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最高，隨后轉(zhuǎn)錄水平又逐漸下降。 在Mjago研究的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)而開展了對(duì)日本囊對(duì)蝦microRNA相關(guān)分子特征的研究。為了從免

7、疫角度對(duì)日本囊對(duì)蝦microRNA進(jìn)行研究，我們以WSSV感染的血細(xì)胞為材料，從中分離并克隆小RNA。運(yùn)用較為靈敏的PCR鑒定方法，從中我們鑒定得到35個(gè)microRNA。序列分析表明血細(xì)胞中部分microRNA表現(xiàn)出了表達(dá)豐度的差異性及進(jìn)化上的保守性，其與已知物種中的microRNA具有極高的同源性，尤其是進(jìn)化關(guān)系上十分接近的果蠅、家蠶等節(jié)肢動(dòng)物來源的microRNA。進(jìn)一步，我們運(yùn)用半定量PCR方法檢測(cè)所鑒定microRNA在WSS