花椰菜和大白菜新種質(zhì)創(chuàng)制.pdf

1、花椰菜（Brassica oleracea var.botrytis）為十字花科（Cruciferae）蕓薹屬甘藍(lán)種的一個(gè)變種，生產(chǎn)中常遭受多種病、蟲害的威脅，如黑腐病、黑脛病、根腫病和蚜蟲等，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)。在花椰菜常規(guī)種中，上述病，蟲害的抗性資源匱乏或者單一，而在十字花科野生植物中存在豐富的異源高抗基因資源。應(yīng)用體細(xì)胞雜交技術(shù)，可以克服常規(guī)種間雜交不親和性，獲得種間雜種，轉(zhuǎn)移來自不同物種的異源抗性基因，豐富育種材料抗性基因的遺

2、傳多樣性，創(chuàng)制新的抗病、蟲種質(zhì)。
　　 本研究第一部分是利用體細(xì)胞雜交技術(shù)向蕓薹屬甘藍(lán)類蔬菜轉(zhuǎn)移野生抗病、蟲等優(yōu)良性狀。
　　 紫羅蘭（M incana）為十字花科紫羅蘭屬的一個(gè)野生種，具有很高的ω-亞麻酸含量以及優(yōu)良的蚜蟲抗性等。本實(shí)驗(yàn)建立了花椰菜和紫羅蘭原生質(zhì)體的PEG融合及培養(yǎng)技術(shù)，首次成功獲得了紫羅蘭與花椰菜的屬間體細(xì)胞雜種再生植株，并對(duì)再生株的形態(tài)學(xué)，分子標(biāo)記特征，染色體數(shù)目，細(xì)胞DNA含量等指標(biāo)進(jìn)行了系統(tǒng)的分

3、析，為異源優(yōu)異種質(zhì)的利用建立了體細(xì)胞雜交技術(shù)基礎(chǔ)。
　　 黑芥（B.nigra）為蕓薹屬三個(gè)基本種之一，多為野生狀態(tài)存在。黑芥中存在對(duì)黑腐病、黑脛病、根腫病等病害高抗、多抗性的基因型。本實(shí)驗(yàn)室通過體細(xì)胞雜交技術(shù)，獲得了眾多花椰菜與黑芥體細(xì)胞雜種.本研究對(duì)利用非對(duì)稱體細(xì)胞雜交技術(shù)獲得并成功移入溫室的79個(gè)花椰菜和黑芥的雜種進(jìn)行全生育期的生物學(xué)特性調(diào)查，內(nèi)容包括植株形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞DNA含量測(cè)定、染色體計(jì)數(shù)、基因組組成、育性調(diào)查等。

4、通過胚挽救技術(shù)獲得了部分雜種的回交后代植株并對(duì)其部分生物學(xué)特性也進(jìn)行了調(diào)查，同時(shí)對(duì)雜種一代及其回交后代進(jìn)行了黑腐病抗性鑒定。
　　 本研究第二部分是利用遠(yuǎn)緣有性雜交手段向白菜中轉(zhuǎn)移野生種黑芥的抗病性狀。大白菜(Brassica campestris ssp.pekinensis)是我國重要的蔬菜作物之一。在種植過程中，常遭受黑腐病、黑脛病和根腫病等病菌的侵染，致使產(chǎn)量下降。通過遠(yuǎn)緣有性雜交手段把黑芥的抗病性轉(zhuǎn)移到白菜中，對(duì)白菜的

5、育種將具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)以品質(zhì)優(yōu)良的感病大白菜為母本，黑芥為父本進(jìn)行雜交，并對(duì)獲得的F1代植株進(jìn)行了形態(tài)學(xué)，細(xì)胞學(xué)和分子標(biāo)記三種手段分析鑒定。通過胚珠和子房培養(yǎng)等胚挽救技術(shù)成功獲得了回交后代，初步的黑腐病菌人工接種鑒定結(jié)果表明，部分回交二代雜種植株中仍具備良好的黑腐病抗性。
　　 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 1.成功建立了紫羅蘭和花椰菜屬間體細(xì)胞雜交體系，獲得了118株再生植株，并對(duì)它們進(jìn)行了形態(tài)學(xué)調(diào)查、RAPD和SRA

6、P分子標(biāo)記鑒定，同工酶譜分析，染色體計(jì)數(shù)和流式細(xì)胞術(shù)核DNA含量檢測(cè)，表明二株為真雜種，且均為混倍體，染色體數(shù)變化范圍為26到48條。對(duì)不同鑒定方法的比較顯示，形態(tài)學(xué)鑒定直觀、簡(jiǎn)便，有較高的判斷率，但SRAP分子標(biāo)記鑒定更準(zhǔn)確可靠。獲得的紫羅蘭和花椰菜屬間體細(xì)胞雜種植株在移栽入地后，生長(zhǎng)緩慢，沒有達(dá)到成株期。
　　 2.對(duì)成功移栽入溫室的79株花椰菜和黑芥的體細(xì)胞雜種進(jìn)行了全生育期性狀調(diào)查分析，內(nèi)容包括細(xì)胞DNA含量測(cè)定、染色體

7、計(jì)數(shù)、植株形態(tài)學(xué)觀察和育性調(diào)查等。雜種形態(tài)變異廣泛，多數(shù)呈中間類型，少數(shù)呈偏親性狀；雜種細(xì)胞DNA含量不一致，呈現(xiàn)大于、等于和小于雙親細(xì)胞DNA含量之和的三種類型；DNA含量大于雙親之和的雜種中，有較高比例的材料葉型出現(xiàn)畸形和（或）植株生長(zhǎng)勢(shì)弱，育性差。顯示出雜種植株的生長(zhǎng)勢(shì)和育性與細(xì)胞的DNA含量具有一定的相關(guān)性。通過染色體計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)所檢測(cè)雜種多為混倍體，即同一植株的細(xì)胞有多種染色體數(shù)目構(gòu)成。在79個(gè)雜種中，篩選出13個(gè)目標(biāo)材料，生長(zhǎng)

8、勢(shì)較強(qiáng)，有較好或一定程度的育性，表明采用體細(xì)胞雜交技術(shù)手段來改良甘藍(lán)類蔬菜的遺傳多樣性具有可行性。
　　 3.根據(jù)結(jié)實(shí)與否選取了可育和不育雜種各二株，對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了對(duì)比分析。不育雜種的花粉母細(xì)胞(PMCs)減數(shù)分裂行為異常的比例遠(yuǎn)高于可育雜種，出現(xiàn)了大量的染色體橋，染色體滯后，染色體不均等分裂等異常行為；對(duì)PMCs終變期觀察表明：不育雜種中出現(xiàn)了大量單價(jià)體；可育雜種中，二價(jià)體數(shù)目明顯提高，單價(jià)體數(shù)目較少?；蚪M原位雜交(G

9、ISH)結(jié)果顯示：可育雜種的體細(xì)胞染色體數(shù)為供、受體染色體數(shù)之和，為對(duì)稱雜種；不育雜種細(xì)胞中含有受體花椰菜的全部基因組以及附加的3-12條供體完整染色體，為低度非對(duì)稱雜種。且附加的黑芥染色體在減Ⅰ期均出現(xiàn)染色體滯后，染色體不均等分裂等異常行為。對(duì)可育和不育雜種的基因組SRAP分子標(biāo)記分析表明：雜種DNA均有重組發(fā)生，且可育雜種的平均新帶比例略大于不育雜種。
　　 4.對(duì)10個(gè)株系的15株BC1雜種進(jìn)行了生物學(xué)特性調(diào)查，內(nèi)容包括細(xì)

10、胞DNA含量測(cè)定、染色體計(jì)數(shù)、植株形態(tài)學(xué)觀察和花粉活力調(diào)查等.雜種形態(tài)多呈中間類型，有三棵植株形態(tài)明顯趨向于受體花椰菜.核DNA含量和染色體數(shù)目均不一致，顯示出混倍特性，但相比于體細(xì)胞雜種一代，其變化范圍明顯變窄，且有接近于受體花椰菜的趨勢(shì)。以花椰菜為父本，共有4個(gè)BC1植株獲得自交和回交種子，一顆植株通過胚挽救技術(shù)獲得回交二代胚苗.
　　 5.采用從北京，湖南等全國六個(gè)省份收集并經(jīng)過鑒定確定的8個(gè)黑腐病菌種以及從英國引進(jìn)的分別

11、屬于Race I和RaceⅣ的二個(gè)生理小種，共10個(gè)黑腐菌種對(duì)融合親本花椰菜和黑芥進(jìn)行苗期抗病性鑒定。篩選出了一個(gè)受體（花椰菜）的病情指數(shù)為70.4，為“高感（HS）”級(jí)別，同時(shí)供體（黑芥）的病情指數(shù)為8.8，達(dá)到“高抗(HR)”級(jí)別的黑腐菌種CHs。用篩選的黑腐菌種CHs對(duì)體細(xì)胞雜種一代及其回交后代植株進(jìn)行抗病性鑒定，結(jié)果顯示部分回交二代雜種植株仍具有良好的黑腐病抗性，病情指數(shù)為15.7，達(dá)到“抗病（R)”級(jí)別。
　　 6.對(duì)

12、獲得的10株白菜×黑芥的F1代植株，經(jīng)形態(tài)學(xué)，細(xì)胞學(xué)和SRAP等方法鑒定出6株為真雜種.其中有一株雜種(H1)體細(xì)胞含有26條染色體，GISH結(jié)果顯示其基因組組成為ABB型，育性相對(duì)較高，獲得了175?；亟灰淮N子；其它5株雜種50％以上的體細(xì)胞含有18條染色體，GISH結(jié)果顯示其基因組組成為AB型，花粉完全敗育，通過胚挽救技術(shù)也未獲得回交后代.由此推測(cè)，染色體數(shù)目的增多和同源染色體的配對(duì)有利于提高雜種的育性.
　　 7.白菜-