鹽脅迫下誘抗劑對(duì)水稻P450基因的擴(kuò)增多態(tài)性分析.pdf

1、在誘抗劑HI能夠提高水稻R6耐鹽能力的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)水稻R6誘導(dǎo)耐鹽相關(guān)基因P450作為研究的目標(biāo)基因，通過(guò)“功能基因擴(kuò)增多態(tài)性”(FGAP)標(biāo)記方法，分析基因組DNA與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)(cDNA序列)的多態(tài)性，并對(duì)特殊的條譜進(jìn)行凝膠回收測(cè)序，分析其特異性。實(shí)驗(yàn)主要結(jié)果如下： 1.藥物處理下的水稻形態(tài)表現(xiàn) 與H2O對(duì)照相比，鹽脅迫下水稻的根長(zhǎng)受到了明顯的抑制，根色發(fā)黃，短而粗，苗高比親本要矮小。與1％NaCl脅迫相比，

2、經(jīng)過(guò)誘抗劑HI預(yù)處理后，根長(zhǎng)得到了誘導(dǎo)，根色變白，比水的粗比鹽的細(xì)，苗高分別介于同一類型植株H2O和鹽處理之間。與鹽脅迫對(duì)照相比，紅霉素、西咪替丁抑制苗高和根長(zhǎng)，利福平促進(jìn)苗高抑制根長(zhǎng)，環(huán)孢素A促進(jìn)根長(zhǎng)且幼苗比鹽處理稍高。 2.采用六種方法提取DNA，結(jié)果顯示液氮研磨法、SDS法、CTAB法所得的基因組DNA效果較好，但在DNA濃度上明顯小于優(yōu)化SDS法；優(yōu)化CTAB法所提取的基因組DNA雖然濃度較大，但純度較差，拖尾較嚴(yán)重；試

3、劑盒提取得到的基因組DNA純度高，DNA量也很充足，并且沒(méi)有RNA污染。 3.不同處理的P450基因cDNA序列多態(tài)性分析 3.1反應(yīng)體系的優(yōu)化結(jié)果。本文改良了陳曉[79]的反轉(zhuǎn)錄體系，將Oligodt引物量由2μl改為1μl，同時(shí)在反應(yīng)條件中增加了25℃溫浴10min后再進(jìn)行42℃的恒溫反應(yīng)，得到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物更為完整，actin引物檢測(cè)時(shí)得到的特異條帶更亮更集中。針對(duì)cDNA的PCR反應(yīng)體系特點(diǎn)，進(jìn)一步改良了朱志凱[7

4、4]和陳曉[79]的PCR反應(yīng)體系，根據(jù)條帶重新優(yōu)化體系，包括反應(yīng)體系的成分用量以及反應(yīng)條件。最終優(yōu)化PCR反應(yīng)體系：20μl PCR反應(yīng)體系中，含60ng模板cDNA，1μl20mM dNTP，0.5 U TaqDNA聚合酶，2.5μl10pM隨機(jī)引物和3.5μL10pM特異引物，復(fù)合退火溫度為隨機(jī)引物35℃，特異引物55℃。 3.2對(duì)目的基因的退火溫度及循環(huán)數(shù)的篩選，T2、T7、T15、P7、P8、P9、P11、P15的最佳

5、退火溫度分別為58℃、55℃、55℃、58℃、55℃、58℃、58℃、58℃，最佳循環(huán)次數(shù)分別為34、32、32、34、34、36、34、32。 3.3篩選引物組合。篩選與光合速率顯著相關(guān)的組合進(jìn)行基因組以及cDNA序列多態(tài)性檢測(cè)，共篩選出30對(duì)引物組合，分別對(duì)水稻R6三種處理(清水、鹽及HI)條件下提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增及RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生多態(tài)性條帶242條，多態(tài)性達(dá)75％，大多數(shù)條帶集中在100-600bp。

6、 3.4聚丙烯酰胺凝膠電泳回收。改進(jìn)了聚丙烯酰胺凝膠回收的方法，將煮沸法融合到一步法中，用特異引物T7和T2擴(kuò)增，得到了158bp和226bp兩條清晰條帶。 4.在鹽脅迫條件下CsA誘導(dǎo)水稻NM001066006基因發(fā)生選擇性剪接。本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)用一種功能基因擴(kuò)增多態(tài)性(Functional Genes Amplified Polymorphism，F(xiàn)GAP)方法中的組合引物對(duì)P3P2，進(jìn)行cDNA序列擴(kuò)增，在CsA作用下，

7、簡(jiǎn)便有效地區(qū)分NM_001066006和NM_001066009的表達(dá)，并對(duì)圖11，12中約530 bp條帶是在NM_001066006中處于195 bp內(nèi)含子，而在NM_001066009中卻處于102 bp外顯子作出合理的解釋，可見水稻P450基因?qū)λ幬顲sA有明顯作用，因而在水稻中利用CsA研究P450基因、MDR基因與抗逆性的相互作用值得深入探討。而FGAP為mRNA選擇性剪接的研究提供了一個(gè)簡(jiǎn)便有效方法。 5.對(duì)194

8、50基因特異條帶回收測(cè)序分析?；厥諚l帶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由上海英俊生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，用H2O、S、HI處理后，不同處理的cDNA序列與NM_190966相同的堿基占70％；在NM_190966基因編碼序列1042bp處，清水和HI處理的水稻R6材料發(fā)生了一個(gè)堿基的缺失；在NM_190966基因編碼序982-1458處，水稻R6材料發(fā)生了65個(gè)堿基變異，其中AC1079CA明顯是顛換的結(jié)果；但有8個(gè)堿基是在鹽脅迫下發(fā)生改變