外源基因在馬鈴薯體內(nèi)表達(dá)的研究.pdf

1、本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別將禽流感病毒H5N1亞型血凝素基因（H5HA）、麥芽糖乙?；D(zhuǎn)移酶基因（MAA）和大腸桿菌腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）編碼基因（glgC）導(dǎo)入馬鈴薯栽培品種Desiree中，對外源基因在馬鈴薯體內(nèi)的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果如下：
　　 1. 將禽流感病毒H5HA基因分別與馬鈴薯淀粉結(jié)合型淀粉合酶I（GBSS I）基因啟動子（Gp）、甘薯貯藏蛋白A（SpoA）基因的啟動子（Sp）和花椰菜花葉病

2、毒（CaMV）35S基因的啟動子（35Sp）融合，構(gòu)建了pBIN19/Gp-H5HA，pBIN19/Sp-H5HA和pBIN19/35Sp-H5HA三個植物表達(dá)載體，研究不同啟動子驅(qū)使下重組基因在馬鈴薯體內(nèi)的表達(dá)。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法對馬鈴薯進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，經(jīng)新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（NPT II）抗性篩選后，Gp-H5HA系列共獲得10株，Sp-H5HA系列共獲得8株，35Sp-H5HA系列共獲得12株。PCR結(jié)果表明，H5HA重組基因成功整合

3、到馬鈴薯基因組中。除此之外，對35Sp-H5HA系列的10個轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行RT-PCR和Western斑點雜交分析，結(jié)果表明H5HA重組基因在馬鈴薯體內(nèi)得到表達(dá)。
　　 2. 從大腸桿菌中克隆了編碼MAA的基因片段，并將該片段與環(huán)狀芽孢桿菌環(huán)狀糊精糖基轉(zhuǎn)移酶（CGTase）的淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域（SBD）連接，構(gòu)建了在馬鈴薯GBSSI啟動子驅(qū)動下的重組基因的植物表達(dá)載體pBIN19/MAA-SBD和pBIN19/SBD-MAA，它們分

4、別用于MAA-SBD（SBD在C-末端）和SBD-MAA（SBD在N-末端）基因在馬鈴薯薯塊中的表達(dá)。與此同時，構(gòu)建了pBIN19/MAA對照質(zhì)粒，用于檢測MAA 蛋白自身是否與淀粉粒之間有親和性。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化馬鈴薯，經(jīng)NPTII抗性篩選后，三個系列共獲得25個轉(zhuǎn)基因株系，PCR分析結(jié)果表明，MAA和MAA/SBD重組基因已分別整合到馬鈴薯基因組中。
　　 3. 將大腸桿菌中編碼腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的glgC基因的序