水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白OsPht1;2和OsPht1;6表達(dá)調(diào)控和功能的研究.pdf

1、磷是最為重要的生命元素之一，幾乎參與所有生命的重要代謝活動。由于化學(xué)和微生物的強烈固定，大多數(shù)自然土壤中的有效磷很低，限制著植物的生長發(fā)育。植物可以通過改變根系形態(tài)結(jié)構(gòu)和增強分泌物質(zhì)提高土壤生物有效態(tài)磷，但最終需要通過植物根系高效的吸收和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)-“磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白”來完成吸收和轉(zhuǎn)運。一般認(rèn)為，Pht1家族磷轉(zhuǎn)運蛋白可能是植物從根系磷的吸收到體內(nèi)磷轉(zhuǎn)運的主要完成者。水稻是最重要的糧食作物之一，也是最為重要的模式作物。因此研究水稻在磷脅迫環(huán)

2、境下的逆境反應(yīng)分子機制，并對其進(jìn)行遺傳改良具有重大的現(xiàn)實意義.在水稻基因組有13個基因編碼的蛋白屬于Pht1高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白家族，其中OsPht1;11（OsPT11）和OsPht1;13（OsPT13）受菌根特異性誘導(dǎo)表達(dá)，然而其他基因在吸收和轉(zhuǎn)運磷素中的功能尚不清楚。通過RT-PCR方法，我們發(fā)現(xiàn)在該家族基因中OsPht1;2和OsPht1;6在缺磷條件下轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量最大。鑒于在過去發(fā)表的文章中已經(jīng)將該家族的磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白簡單定義

3、為OsPT，為了便于比較和簡單化，本文中所研究的兩個基因分別采用OsPT2和OsPT6命名。本研究以模式品種日本晴(Nipponbare)為材料，通過RT-PCR、轉(zhuǎn)基因和蛙卵等異源表達(dá)體系、電生理等方法研究了OsPT2和OsPT6的功能和表達(dá)調(diào)控，所獲得的主要結(jié)果如下：
　　 1.通過對OsPT2和OsPT6兩基因的氨基酸序列比對以及其磷酸化位點、糖基化位點、跨膜性等方面分析得出OsPT2和OsPT6具有Pht1家族基因的典型

4、特征，它們的同源性達(dá)到70％。通過序列比對分析，表明OsPT2和OsPT6在水稻基因組中都是以單拷貝形式存在，兩者都沒有內(nèi)含子。OsPT2基因位于第3條染色體，而OsPT6基因位于第8條染色體。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，OsPT2和OsPT6基因在Pht1家族基因里面不屬于同一個小亞類，說明它們在功能上可能存在差異。對OsPT2和OsPT6基因啟動子序列分析發(fā)現(xiàn)，兩個基因的啟動子里面都含有兩個W-box，一個P1BS，而在OsPT6基因啟動子

5、序列中發(fā)現(xiàn)了兩個PHO-like element基序，據(jù)前人研究這三個可能是參與磷饑餓信號的調(diào)控因子在下游基因啟動子中的結(jié)合位點（元件）。
　　 2.OsPT2和OsPT6分別與GFP融合，形成的融合蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞表達(dá)分析表明OsPT2和OsPT6都定位于細(xì)胞質(zhì)膜上，說明它們確實是質(zhì)膜蛋白基因，符合Pht1家族的基本特性。通過RT-PCR分析，表明OsPT2和OsPT6在缺磷條件下在根部均強烈增強表達(dá)；在葉片中缺磷同樣導(dǎo)致O

6、sPT6表達(dá)的明顯增強，但OsPT2的表達(dá)量增強相對較弱。
　　 3.為了研究OsPT2和OsPT6基因的時空表達(dá)和對磷饑餓的響應(yīng)，我們擴增了OsPT2和OsPT6基因ATG上游5’端序列，長度分別為1670bp和2380bp用作表達(dá)分析，GUS基因作為報告基因，用來檢測兩個基因的時空表達(dá)。把重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入日本晴水稻中，并且整合到染色體上，經(jīng)過轉(zhuǎn)基因得到Ti代轉(zhuǎn)基因苗，在高磷和低磷處理時來分析OsPT2和OsPT6基因的時空表達(dá)

7、譜。我們發(fā)現(xiàn)在缺磷三周后，OsPT2基因表達(dá)部位主要集中在根尖、側(cè)根發(fā)生區(qū)和根莖結(jié)合部的中柱部分。從組織切片結(jié)果可以看到，GUS報告基因主要在根尖的導(dǎo)管薄壁細(xì)胞中有表達(dá)，而表皮和皮層均未發(fā)現(xiàn)GUS基因表達(dá)；在側(cè)根發(fā)生區(qū)，同樣只有在中柱部位有明顯表達(dá)；在根冠部位沒有發(fā)現(xiàn)有GUS表達(dá)。說明OsPT2在缺磷或者低磷環(huán)境中主要負(fù)責(zé)把根中的磷酸鹽轉(zhuǎn)運到地上部去。
　　 同樣缺磷處理三周后，OsPT6基因在幼嫩的主根，側(cè)根和根莖結(jié)合部位有明

8、顯的GUS基因表達(dá)，而在供應(yīng)了0.3 mM Pi處理植株中，沒有發(fā)現(xiàn)這些部位有報告基因的表達(dá)。OsPT6基因在幼根和側(cè)根的表皮、皮層和中柱細(xì)胞均有很強的表達(dá)。但是側(cè)根發(fā)生區(qū)，在主根的表達(dá)減弱，而在側(cè)根生長點表達(dá)很強。同時也發(fā)現(xiàn)，在根冠部位沒有GUS表達(dá)。說明OsPT6在缺磷或者低磷環(huán)境中同時負(fù)責(zé)吸收和運輸磷酸鹽。
　　 我們還發(fā)現(xiàn)，在缺磷條件下在葉片中均檢測出OsPT2和OsPT6兩個基因各自的內(nèi)源啟動子所驅(qū)動的GUS表達(dá)，而在

9、正常供磷條件下其表達(dá)明顯減弱。OsPT2和OsPT6兩個基因在一些成熟器官中也有表達(dá)。OsPT2在灌漿期種子和發(fā)芽種子中表達(dá)，OsPT6在花藥和發(fā)芽種子中都能檢測到。
　　 4.蛙卵細(xì)胞中表達(dá)OsPT2和OsPT6可使細(xì)胞中磷的吸收量分別提高5倍和7倍，微電極測定細(xì)胞膜電位變化分析發(fā)現(xiàn)供應(yīng)1 mM Pi可使表達(dá)OsPT2的蛙卵細(xì)胞去極化，這種去極化程度隨著供應(yīng)的磷濃度提高到10 mM而大幅提高。表明OsPT2是低親和力的磷酸鹽轉(zhuǎn)

10、運蛋白，而且是2個摩爾以上質(zhì)子與1個摩爾H2PO4-的共轉(zhuǎn)運或3個摩爾以上的質(zhì)子與1個摩爾HPO42-的共轉(zhuǎn)運蛋白。然而表達(dá)OsPT6的蛙卵細(xì)胞檢測不到介質(zhì)磷酸鹽的供應(yīng)對細(xì)胞膜電位的變化，表明有別于OsPT2， OsPT6可能是一個高親和力的磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白，也可能是與質(zhì)子共轉(zhuǎn)運但凈電荷呈中性的磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白。
　　 5.通過泛素啟動子驅(qū)動OsPT6在水稻（日本晴）中的超表達(dá)，獲得了在正常供磷條件下與野生型相比OsPT6顯著增強的

11、多個株系.在正常供磷條件下OsPT6的過量表達(dá)能大幅提高水稻地上部分磷的積累，植株表現(xiàn)出矮小，老葉枯斑和枯死等磷毒害癥狀.這種類似磷毒害癥狀能隨著外源供應(yīng)磷的濃度下降而得到緩解，說明OsPT6參與調(diào)控了水稻體內(nèi)磷素的平衡。
　　 6.通過構(gòu)建含有可能與磷信號轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的不同基序以及拷貝數(shù)的啟動子與GUS報告基因融合基因轉(zhuǎn)化水稻，發(fā)現(xiàn)在水稻體內(nèi)P1BS和W-box兩種基序為磷饑餓反應(yīng)的結(jié)合元件，它們是水稻OsPT6基因磷饑餓下高

12、度特異表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵元件，同時發(fā)現(xiàn)W-box的拷貝數(shù)與該基因在缺磷或者低磷條件下的表達(dá)豐度相關(guān)，拷貝數(shù)越大表達(dá)量越強。
　　 綜合上述結(jié)果，我們認(rèn)為水稻體內(nèi)存在非常復(fù)雜的磷信號途徑。盡管OsPT2和OsPT6均是缺磷增強表達(dá)的磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白，但它們可能接受上游的磷信號途徑不完全相同，兩者的表達(dá)部位、對磷酸鹽的親和力和對介質(zhì)酸度的要求等功能方面表現(xiàn)很大的差異。利用不同磷素供應(yīng)條件和不同部位表達(dá)的特異和人工啟動子有可能能改變它們的表