RNA干涉介導(dǎo)的馬鈴薯抗病毒研究.pdf

1、馬鈴薯是一種重要的全球性經(jīng)濟作物，馬鈴薯病毒是引起馬鈴薯退化的重要原因。馬鈴薯X病毒(Potato virus X,PVX)、馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、馬鈴薯卷葉病毒(Potato leaf roll virus,PLRV)是嚴(yán)重危害我國馬鈴薯產(chǎn)量的三種主要病毒，在田問病毒病多混合發(fā)生，給馬鈴薯生產(chǎn)帶來巨大損失。獲得同時對三種病毒具有抗性的馬鈴薯植株顯得尤為重要。RNAi是一種基因沉默現(xiàn)象，大量研究表明，將病

2、毒基因片段以反向重復(fù)的方式導(dǎo)入植物，其轉(zhuǎn)錄會形成具有雙鏈結(jié)構(gòu)的發(fā)夾RNA(hairpin RNA,hpRNA)，可有效地引發(fā)RNA干涉，能對入侵的病毒RNA進(jìn)行降解，使入侵的病毒不能在植物中積累，從而賦予轉(zhuǎn)基因植物病毒抗性。為了培育同時抗三種病毒的馬鈴薯品種，本研究基于RNAi原理設(shè)計并構(gòu)建了分別用于抗馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯卷葉病毒基因工程的三個單價RNAi載體，和用于同時抗三種病毒基因工程的三價RNAi載體。并利用農(nóng)桿菌滲

3、入法(Agroinfiltration)介導(dǎo)的瞬時表達(dá)分析了所構(gòu)建載體的干涉效果，具體結(jié)果如下：
　　首先通過TC-RT-PCR技術(shù)克隆了貴州省幾個地區(qū)的PVX、PVY、PLRV外殼蛋白（Coat Protein CP）基因。測序后與GenBank上已報道的序列比對，選擇保守區(qū)設(shè)計含attB位點的特異性引物，擴增出三種病毒CP基因3’端約300bp的基因片段。建立的用于克隆馬鈴薯病毒相關(guān)基因的TC-RT-PCR技術(shù)簡單、快速，靈敏

4、度可靠。
　　將三種病毒的CP基因片段利用Overlap-PCR進(jìn)行拼接融合，再通過Gateway Cloning System構(gòu)建含有intron的可用于同時沉默三種病毒CP基因的RNAi載體pHellsgate12-YRX。同時將三種病毒CP基因片段分別通過Gateway Cloning System構(gòu)建含有intron的RNAi載體pHellsgate12-X302、pHellsgate12-Y300、pHellsgate1

5、2-R327。Overlap-PCR無需酶切連接在體外通過PCR即可將多個基因片段拼接融合，省時省力。利用Gateway技術(shù)構(gòu)建RNAi載體避免了復(fù)雜的酶切連接且不受酶切位點的限制，方便高效。
　　采用農(nóng)桿菌滲入法介導(dǎo)的瞬時表達(dá)分析所構(gòu)建的幾個載體的干涉效果，將pHellsgate12-X302、pHellsgate12-Y300轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105后，分別浸潤15株6周齡的本氏煙，摩擦接種后，DAS-ELISA檢測，浸潤pHe

6、llsgate12-X302的無一株發(fā)病，浸潤pHellsgate12-Y300的僅一株發(fā)病，對照全部發(fā)病。45株浸潤含pHellsgate12-YRX載體EHA105農(nóng)桿菌的6周齡本氏煙，其中15株摩擦接種PVX，有一株發(fā)病，15株摩擦接種PVY，無一株發(fā)病，15株同時摩擦接種PVX和PVY，有兩株表現(xiàn)花葉癥狀?？梢猿醪阶C明所構(gòu)建載體的干涉效果。農(nóng)桿菌滲入法介導(dǎo)的瞬時表達(dá)周期短，表達(dá)水平高，且不受轉(zhuǎn)基因植株常遇到的位置效應(yīng)的影響，為快